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背景1993年Dahlback等首次报道了抗活化蛋白C症(Resistance to activated protein C, APC-R)。目前的研究证实,APC-R的主要分子学机制是凝血因子V(FV)基因突变导致氨基酸变异(FV Arg506Gln, FV Leiden),它是高加索人群中发生率最高的血栓危险因素(遗传性易栓症)之一。但FV Leiden突变分布具有明显的地域性差异,在我国、韩国和日本等亚洲国家,无论健康人或血栓患者,虽可发现APC-R阳性,但FV Leiden的检出率几乎为零,提示亚洲人群中可能存在除FVLeiden以外的其他与APC-R相关且伴高血栓倾向的基因缺陷。目的研究一遗传性APC-R且伴静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)史的家系的临床和分子发病机制,以期发现新的与APC-R相关的遗传缺陷,并初步探讨与新遗传缺陷相关的凝血因子功能异常。方法1.采集1例APC-R阳性的VTE患者(先证者)及家系成员(4例)的临床资料和血液样本,进行系统的家系调查。2.采用凝固法检测APC-R、蛋白S,采用发色底物法检测蛋白C、抗凝血酶,采用一期法测定凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性(FV:C, FVⅢ:C).3.采用PCR-RELP和直接测序方法除外FV Leiden突变、FV Cambridge/HongKong突变。4.扩增FV基因的25个外显子,对其PCR产物直接测序,将测序结果与Genebank已知的DNA序列进行比较。5.在健康体检者和血栓性疾病患者中筛查新发现的FV基因突变,比较两者的等位基因频率。6.将先证者血浆／标准血浆以不同比例与乏FV血浆混合后利用凝血法(COATEST(?) APCTM Resistance Kit)测定APC-sr值,初步探讨异常FV导致APC-R的机制。结果1.先证者为53岁女性,因左下肢肿痛、进行性呼吸困难,经下肢血管彩超、CT肺血管造影等检查,确诊下肢深静脉血栓和肺栓塞。经查,患者除APC-R阳性外,无其他常见的获得性或遗传性易栓因素。经低分子肝素继之口服华法林抗凝治疗症状缓解,至今已随访16个月,VTE未复发。2.先证者的双亲非近亲结婚,家族中曾有一姐2年死于“VTE”,其余成员均无血栓事件。5名家系成员中有4人(包括先证者)检出APC-R阳性,另1人为APC-R阴性；其余易栓指标(包括抗磷脂抗体、PS, PC, AT-ⅢFVⅢ:C等)均阴性。确定为遗传性APC-R家系,符合常染色体显性遗传规律。3.全部家系成员均未检出FV Leiden和FV Cambridge/Hong Kong突变等常见引起APC-R的FV基因缺陷。4.测序结果经比较,鉴定到2个突变位点,分别是：①第10外显子中的第1628个核苷酸突变(G1628→A),导致第485个氨基酸置换(R485K)。FV R485K为种已报道可能与APC-R相关的FV基因突变,但该突变以纯合状态同时存在于该家系中所有成员,且其在健康体检者和APC-R阴性的血栓性疾病患者中等位基因频率(A)分别为64%、60%,两者无显著差异；②第13外显子中的第2172个核苷酸突变(G2172→C),导致第666个氨基酸置换(E666D)。FV E666D为一新发现的FV基因突变,以杂合状态存在于该家系中所有APC-R阳性成员,而在阴性成员中则缺乏,在健康体检者和APC-R阴性的血栓性疾病患者中也均未被检出。FVE666D位于APC水解FVa的第3个位点-Arg679附近,有可能通过干扰APC对FVa的水解引起APC-R。5.由于FVa对APC的敏感性与FV浓度无关,而APC辅因子活性可随FV浓度增加而增加。利用含FV E666D突变蛋白的先证者血浆进行的初步功能研究显示,在FV比例很低的情况下(即FV为2.5%),先证者血浆与标准血浆的APC-sr值的差异不大,提示异常FV被APC灭活的敏感性与正常FV相当；随FV比例的增加,先证者血浆的APC-sr值的增加幅度(即斜率)小于正常血浆,提示异常FV作为APC裂解FVⅢa的辅因子活性低于正常FV。结论1.本研究发现并证实了我国首个伴有VTE家族史的遗传性APC-R家系。2.在国际上首次发现FV基因第13外显子E666D突变(FV E666D),此突变在该家系所有APC-R阳性成员中以杂合状态存在,在APC-R阴性家系成员、健康体检者和APC-R阴性血栓患者中均未检出,很可能为该家系APC-R的遗传缺陷。3.FV R485K的等位基因频率(A)明显高于国内(包括香港地区)的报道,与泰国相当。其在健康体检者和血栓性疾病中分布相当,提示该突变与血栓性疾病无关。4.含FV E666D突变蛋白作为APC裂解FVⅢa的辅因子活性低于正常FV,可能与其导致APC-R有关。但此结果需要重组蛋白的研究进一步证实。