研究背景胃穿孔是胃壁组织的全层损伤,常由创伤、严重的消化性溃疡、肿瘤进展和内镜手术等原因导致。除非得到及时治疗,否则胃内容物渗漏到腹腔会导致剧烈的疼痛、严重的炎症反应甚至危及生命的脓毒症。目前胃穿孔的治疗主要依靠手术和内窥镜下封堵。然而,手术治疗往往会导致严重的创伤,并且长时间的手术会可能导致更多的胃内容物渗漏到腹腔。内镜下的钛夹和封堵器也被广泛用于修复胃穿孔,但无论是超范围夹子（OTSC）还是穿透式夹子（TTSC）对脆性的组织,比如十二指肠或者炎症组织效果较差;同时目前应用于胃穿孔的封堵器是不可降解的金属或者塑料材质,往往需要进行第二次手术来移除。此外,用于胃肠道穿孔的水凝胶近年来也有报道,水凝胶可粘合伤口组织并作为胃粘膜替代屏障隔离胃部环境。但已经报道的大多数水凝胶缺乏促进伤口愈合或者防治出血等生物学功能,而且缺乏完整、连续的内镜随访和胃部微环境检测来证实其疗效。因此,研发一种具有载药能力、内镜下可递送、有效封堵胃穿孔、防治出血、促进愈合的水凝胶封堵器具有重要的临床意义。研究方法1.合成双交联水凝胶并进行表征使用二甲基丙烯酰胺（DMA）和海藻酸钠（SA）为分子骨架,胱胺双丙烯酰胺（CBA）和钙离子为交联剂合成双交联水凝胶（Dimethylacrylamide-sodium alginate hydrogel,DMA-SA hydrogel）。采用傅里叶变换光谱对合成的水凝胶基团进行表征。2.对双交联水凝胶的机械性能、溶胀特点、粘附性、生物相容性、降解性进行测试（1）调整CBA/DMA比例为0.04%,0.15%和0.3%分别合成低CBA交联剂水凝胶（LCH）、中CBA交联剂水凝胶（MCH）和高CBA交联剂水凝胶（HCH）,使用万能力学测试仪分别行拉伸和80%应变下压缩测试,得到水凝胶最大拉伸应力、拉伸应变、断裂能量和压缩应力;（2）将冻干后的水凝胶分别浸泡于磷酸盐缓冲液（PBS）和稀盐酸溶液中,以测试水凝胶在中性和酸性环境下的溶胀特点;（3）通过粘性实验测试水凝胶在纳米二氧化硅颗粒（SNPs）介导下对玻璃片和水凝胶自身的粘附性能;（4）使用与水凝胶共孵育24小时的培养基培养3T3细胞,在培养后第1天、第2天、第3天使用CCK8测试细胞活性;（5）将片状水凝胶植入大鼠背部皮肤,定期取出皮肤组织和凝胶,以评价水凝胶的生物学毒性和降解性能。3.构建蘑菇帽状水凝胶封堵器,测试其体外封堵猪胃穿孔的能力（1）通过卷曲超薄水凝胶片构建蘑菇帽状封堵器;（2）使用体外猪胃穿孔模型测试纳米二氧化硅颗粒、水凝胶封堵器及覆盖纳米二氧化硅颗粒的封堵器对胃穿孔的封堵效果。4.测试蘑菇帽状水凝胶封堵器装载和释放药物的功能将荧光素钠（SF）、新型质子泵抑制剂伏诺拉生（VF）和酸性成纤维细胞生长因子（AFGF）分别载入封堵器,通过吸光度测定、高压液相色谱检测及细胞增殖能力测试评价蘑菇帽状封堵器对药物的缓释功能。5.采用外科手术的方式构建家兔和小香猪的急性胃穿孔模型,验证水凝胶封堵器的治疗功能（1）采用外科手术的方式构建家兔急性胃穿孔模型,穿孔直径约10 mm。分别将单纯封堵器、装载有VF或者AFGF的封堵器置于家兔胃穿孔部位,并在术后第3天、7天、14天、28天进行胃镜检查。第28天胃镜检查之后,处死动物获取胃组织,进行免疫组化染色以评价伤口部位的愈合情况。（2）采用外科手术的方式构建小香猪急性胃穿孔模型,穿孔直径约10 mm。采用上述三种水凝胶封堵器治疗穿孔,同时把无线p H胶囊置入胃内来实时监测胃内p H值术后三天的变化。在术后第7天和第28天分别进行胃镜检查,第28天胃镜检查之后,处死动物获取胃组织,并进行免疫组化染色以评价伤口部位的愈合情况。6.采用内镜技术,将蘑菇帽状水凝胶封堵器置于猪胃穿孔部位,并评价其治疗效果采用内镜技术构建小香猪急性胃穿孔模型,伤口直径约10 mm。用活检钳固定水凝胶封堵器,通过胃镜经食管释放到胃穿孔部位,验证封堵器微创释放和治疗胃穿孔的功能。研究结果1.水凝胶的合成基于DMA和SA合成了双交联水凝胶;FT-IR检测中,酰胺键的位移显示双交联水凝胶成功合成。2.水凝胶的表征（1）MCH水凝胶在拉伸和压缩测试中显示出更好的延展性（6倍）和机械强度（拉伸应力:265±10 k Pa,断裂能:11622±849 J/m~2,压缩应力:1239±69 k Pa）。（2）三种水凝胶无论是在酸性还是中性环境下都有较好溶胀性,在中性环境中溶胀率都大于30倍,在酸性环境中都大于14倍。结合机械性能和溶胀特点选择MCH进行后续实验。（3）MCH水凝胶在纳米二氧化硅颗粒介导下具有更好的粘性,对玻璃片和水凝胶自身的粘附能力分别达到81±5 k Pa和18±3 k Pa。（4）与完全培养基比较,水凝胶共孵育的条件培养基不影响3T3细胞的正常增殖,孵育1天、2天和3天对照组和水凝胶组的细胞数分别为:43500±3500、90500±9000、350000±48000和45000±5600、85000±7500、320000±69000（p＞0.05）,两组之间没有明显差异。（5）水凝胶不会影响伤口愈合,没有引起明显的炎性细胞聚集。皮下包埋1周、2周、4周、和8周后取出的水凝胶面积分别为257±41 mm~2、211±17 mm~2、151±16 mm~2和120±19 mm~2,2周之后水凝胶表面出现裂纹和空洞,4周之后体积明显缩小。3.体外蘑菇帽状水凝胶封堵器封堵猪胃穿孔（1）通过卷曲水凝胶片成功构建了具有洋葱样结构的蘑菇帽状水凝胶;（2）水凝胶封堵器无论表面是否覆盖有SNPs都可以有效封堵胃穿孔,单纯SNPs虽然不能封堵胃穿孔,但可以提高水凝胶的封堵能力。4.水凝胶封堵器具有缓释药物功能水凝胶封堵器可以装载和缓释荧光素钠、伏诺拉生和成纤维细胞生长因子,其中成纤维细胞生长因子可以促进细胞增殖,且封堵器释放的生长因子其促进增殖的能力和等量直接溶解的纤维细胞生长因子没有明显差异。5.水凝胶封堵器治疗兔子和小香猪急性胃穿孔,促进伤口愈合,防治出血（1）在家兔胃穿孔模型中,水凝胶封堵器可以快速效封堵穿孔,装载成纤维细胞生长因子的封堵器可以促进伤口愈合。（2）在小香猪胃穿孔模型中,水凝胶封堵器可以快速有效封堵穿孔,装载成纤维细胞生长因子的封堵器可以促进伤口愈合,同时装载有伏诺拉生的封堵器可以维持胃内p H大于4超过60个小时,有效防治出血。6.水凝胶封堵器微创释放,封堵胃穿孔水凝胶封堵器可以通过胃镜经食管释放并封堵胃穿孔,96小时后胃镜下观察显示封堵器可以有效封堵伤口。结论我们研发了一种基于水凝胶的具有可降解及缓释药物功能的蘑菇帽状封堵器,可以通过内镜递送及时封堵胃穿孔。该水凝胶封堵器具有微创递送、及时有效封堵、抑制胃酸分泌、促进愈合、可降解、组织相容性好等优点,为急性胃穿孔的临床治疗提供了一种新的手段。