背景:原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。目前化疗仍旧是晚期肝癌的重要治疗方法。由于潜在的肝功能障碍及肝癌细胞对传统化疗药物的抵抗,肝癌患者对化疗的耐受性普遍较差。因此筛选有效的抗肝癌新药及为肝癌患者制定个性化的治疗方案成了亟待解决的问题。传统的肝癌药敏试验大多采用二维培养(two-dimensional culture,2D culture)的肿瘤细胞模型,然而该模型并不能还原肿瘤细胞在体内时的三维结构及肿瘤微环境,使得药敏试验对临床药物疗效的预测能力较差。三维聚球培养是一种成熟的体外细胞培养方法,能很好地还原肿瘤细胞的三维结构,重建细胞微环境。三维肿瘤模型的体外药敏实验相较于二维肿瘤模型更加可靠,因而推荐在个体化治疗中使用三维肿瘤模型进行药敏实验。目前商品化的细胞体外成球培养系统存在价格高昂,成球不均一等缺点。因此开发新的廉价、成球均一性好的三维培养(three-dimensional culture,3D culture)工具具有实际意义,有助于推进肝癌的个体化治疗研究。目的:研发一种成本较低、操作简便、成球效果好的三维细胞成球培养工具,为肝癌的个体化治疗提供指导。方法:第一章印章式聚球培养工具的构建和评价培养工具构建:借鉴商品化细胞成球培养工具,创新性地设计印章式聚球培养工具,然后用SOLIDWORKS 2016软件将其绘制成图。通过3D打印技术将三维培养系统的模具打印成型,用模具塑形96板内的琼脂糖,形成琼脂糖聚球微孔板。培养系统评价:将4种常见肝癌细胞接种于琼脂糖聚球微孔板及超低吸附圆底 96 孔板(Ultralow Attachment round-Bottom 96-Well Plate)中,分别观察不同时间段肝癌细胞在两种培养体系中的形态变化及细胞活率。此外,将肝癌细胞系分别接种于平板培养瓶及琼脂糖微孔板中,对比两种培养方式中细胞的药物代谢相关基因的表达差异。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验采用胶原酶消化法和Percoll密度梯度离心法分离纯化人原代肝癌细胞,用免疫荧光法鉴定原代细胞中肝癌细胞的比例。将原代细胞接种于琼脂糖微孔板中,待细胞成球后收集部分细胞球和来源肿瘤组织做Arg-1免疫组化染色,进行比较。同时于另一部分三维培养细胞中分别加入4组抗肿瘤药物进行共培养。然后用ATP法测定细胞活率,计算药物对肿瘤细胞的抑制率,最后通过敏感程度分级对结果进行分析,评价敏感药物。结果:第一章印章式聚球培养工具的构建和评价3D打印而成的印章式三维培养模具表面光滑,结构完整,塑形后的琼脂糖基质结构完好。相较于超低吸附96孔板,琼脂糖微孔板内的4种肝癌细胞成球更快,形成细胞球形态更均匀。肝癌细胞能在琼脂糖微孔板中培养超过14天。细胞功能检测显示,三维培养的肝细胞其药物代谢相关基因表达水平比二维培养的细胞更高。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验成功分离4例人原代肝癌细胞,4例原代细胞均能在琼脂糖微孔板中聚集成球。药敏结果显示,原代肝癌细胞对4组抗肿瘤药物有不同的反应,相较于其他3组抗肿瘤药物,多柔比星显示出更好的抑制效果。结论:本课题应用3D打印技术和琼脂糖构建了一种新型三维细胞培养系统。肝癌细胞能在此系统中快速成球,所成球体大小均一,良好地还原的肝癌细胞在体内时的三维结构。实验发现三维培养的肝癌细胞功能优于二维培养的细胞。原代肝癌细胞三维药敏实验显示,不同病人的肝癌细胞对抗肿瘤药物有不同的敏感谱。该三维培养系统具有成本低廉,成球效果好,易于换液等优点,具有一定的实用价值,本实验为肝癌患者的个体化治疗提供了一定参考。