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目的以卵巢切除所致的大鼠骨质疏松症为模型,采用骨组织形态计量学方法,观察具有温补肾阳作用的单味中药续断、鹿衔草以及锁阳对其的治疗作用,并从破骨细胞分化调节因子OPG、RANKL以及与骨代谢密切相关的细胞因子IL-1、IL-6的角度,探讨其作用环节及作用特点,为中医药治疗骨质疏松症及“肾主骨”机理提供进一步的实验依据。方法本实验选用雌性Wistar大鼠81只,体重250±20g, SPF级。将81只雌性Wistar大鼠随机分为3组：空白对照组12只、假手术组12只和造模组57只。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉后,摘除双侧卵巢；假手术组摘取少许脂肪组织。术后1个月,再将造模组大鼠随机分为5组：模型组12只、己烯雌酚组12只、续断组11只、鹿衔草组11只和锁阳组11只。开始灌胃给药：中药组灌胃给予浓度为1g生药／m1的水煎剂,给药体积均为5.6ml/kg体重,即给药剂量为5.6g/kg体重；己烯雌酚组灌胃给予0.008mg/ml的己烯雌酚,给药剂量为0.0448mg/kg体重；空白对照组、假手术组、模型组则灌服等体积的蒸馏水。以上各组大鼠灌胃给药3个月,每日1次,连续灌胃给药6天,中间休息1天。大鼠于处死前15天和前3天分别给予腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重,对骨进行荧光标记。在灌胃给药结束后,每组大鼠均以45mg/kg剂量的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉,采用股动脉取血,所取全血静置1个小时后,经2000mp离心10 min后取血清,-20℃冰冻保存备用,用于IL-1、IL-6.含量的检测。然后,将大鼠迅速麻醉处死,取右侧胫骨,用4%多聚甲醛溶液固定,制作不脱钙骨切片,用于骨组织形态计量学检测；取左侧胫骨用0.1M PBS(PH7.3)配制的4%多聚甲醛溶液固定,制作脱钙的冰冻切片用于OPG、RANKL蛋白和其mRNA表达检测。统计学分析实验结果皆采用均数±标准差(x±s)表示,以单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理,组间两两比较,采用q检验。结果1续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响1.1续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨骨小梁体积百分比(TBV%)的影响模型组大鼠胫骨TBV%较假手术组降低。与模型组比较,续断组、鹿衔草组和阳性对照组的大鼠胫骨TBV%显著增加；而锁阳组则无显著性差异。续断组、鹿衔草组和锁阳组大鼠胫骨TBV%较假手术组明显降低,阳性对照组较假手术组则无显著性差异。见表1。注：与假手术组比较：*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△p<0.01。下同。1.2续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨骨小梁吸收表面百分比(TRS%)的影响与假手术组相比,模型组大鼠胫骨TRS%明显增加。续断组、鹿衔草组及阳性对照组较模型组大鼠胫骨TRS%明显降低；锁阳组较模型组则无显著性变化。续断组、锁阳组与假手术组相比,显著增高；鹿衔草组和阳性对照组较假手术组则无显著性差异。见表2。1.3续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨骨小梁形成表面百分比(TFS%)和骨小梁矿化率(MAR)的影响模型组鼠胫骨TFS%和MAR明显高于假手术组。与模型组相比,续断组和阳性对照组大鼠胫骨TFS%和MAR显著降低,鹿衔草组、锁阳组则无显著性差异。与假手术组相比,续断组、鹿衔草组和锁阳组均显著增高,阳性对照组则无明显差异。以上结果见表3。1.4续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨骨皮质矿化率(mAR)和类皮质平均宽度(OSW)的影响模型组较假手术组大鼠胫骨mAR和OSW明显升高。续断组、鹿衔草组和锁阳组较模型组大鼠胫骨mAR和OSW均无显著性差异,但较假手术组均升高。阳性对照组大鼠胫骨mAR和OSW低于模型组,与假手术组无显著性差异。结果见表4。2续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG和RANKL表达的影响2.1续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达的影响与假手术组相比,模型组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达均明显降低。与模型组相比,鹿衔草组和阳性对照组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达明显增高；续断组、锁阳组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达无显著差异。续断组、锁阳组较假手术组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG蛋白表达明显降低；鹿衔草组和阳性对照组与假手术组相比,无显著性差异。以上结果见表5。2.2续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞RANKL蛋白表达的影响模型组大鼠胫骨成骨细胞RANKL蛋白表达明显高于假手术组。续断组、鹿衔草组以及阳性对照组大鼠胫骨成骨细胞RANKL蛋白表达较模型组显著下调,锁阳组无显著性变化。与假手术组相比,续断组与锁阳组大鼠胫骨成骨细胞RANKL蛋白表达显著上调；鹿衔草组和阳性对照组则无明显差异。模型组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL蛋白表达高于假手术组。与模型组比较,续断组、鹿衔草组以及阳性对照组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL蛋白表达均明显下调；锁阳组与模型组相比,无显著差异。续断组、鹿衔草和锁阳组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL蛋白表达均高于假手术组,而阳性对照组与假手术组则无明显差异。以上结果见表6。2.3续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG mRNA表达的影响与假手术组相比,模型组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG mRNA表达均明显下调。与模型组相比,鹿衔草组和阳性对照组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG mRNA表达明显上调；续断组、锁阳组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG mRNA表达无显著差异。续断组、锁阳组较假手术组大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞OPG mRNA表达显著下调；鹿衔草组和阳性对照组与假手术组相比,无显著性差异。以上结果见表7。2.4续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠胫骨成骨细胞和骨髓基质细胞RANKL mRNA表达的影响模型组大鼠胫骨成骨细胞RANKL mRNA表达明显高于假手术组。续断组、鹿衔草以及阳性对照组大鼠胫骨成骨细胞RANKL mRNA表达较模型组明显降低,锁阳组则无明显差异。与假手术组相比,续断组、鹿衔草、锁阳组以及阳性对照组均无显著性差异。模型组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL mRNA表达高于假手术组。与模型组比较,续断组、鹿衔草组以及阳性对照组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL mRNA表达均明显下调；锁阳组则无显著差异。续断组和锁阳组大鼠胫骨骨髓基质细胞RANKL mRNA表达均高于假手术组,而鹿衔草组、阳性对照组与假手术组则无明显差异。以上结果见表8。3续断、鹿衔草和锁阳对去卵巢大鼠外周血血清中IL-1和IL-6含量的影响与假手术组相比,模型组大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量显著增高。与模型组相比,鹿衔草组和阳性对照组大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量显著降低,续断组IL-6的含量亦明显降低；锁阳组大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量无显著差异。续断组、锁阳组较假手术组大鼠外周血血清中IL-1、IL-6的含量均显著增高,鹿衔草组的IL-6含量亦明显增高；鹿衔草组的IL-1的含量及阳性对照组的IL-1、IL-6含量与假手术组相比,均无显著性差异。以上结果见表9。与空白对照组相比,假手术组的上述指标均无显著性差异,从而排除了手术本身对实验的影响。结论(1)续断、鹿衔草对卵巢切除所造成的高转换型骨质疏松症具有一定的治疗作用,而锁阳则无明显的作用。(2)鹿衔草的作用环节是,其不仅能提高成骨细胞和骨髓基质细胞OPG的蛋白及其mRNA表达,而且能抑制RANKL的蛋白及其mRNA表达；并可降低外周血中IL-1、IL-6的水平,从而达到对骨质疏松症的治疗作用。(3)续断的作用环节是其可降低RANKL的蛋白及其mRNA表达,从而使RANK与RANKL的结合减少,进而减少了骨的过度吸收；此外,其还对IL-6水平有一定的抑制作用。