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目的:将 N-端含有 His-tag标签的具底物杂泛性的芒果 C-糖基转移酶 MiCGTb通过 Ni-柱进行初步纯化,然后再通过多级 HPLC分离得到高纯度蛋白。通过对不同序列长度的蛋白的结晶条件(包括温度、缓冲液、pH、蛋白浓度、沉淀剂等)的筛选,最终确定适合进行结构研究的蛋白序列长度,得到没有底物(受体或供体)结合的糖基转移酶的晶体结构,并初步确定其催化活性中心。 方法:1、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶 MiCGTb基因通过设计引物克隆扩增连接到pET28载体上,其C-糖基转移酶MiCGTb的N-端含有His-tag标签和TEV酶切位点,构建的pET28-MiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。 2、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶MiCGTb基因通过蛋白混乱度系统分析,分别将其N-端和C-端的7个和5个氨基酸截去,之后通过设计引物克隆扩增连接到 pET28载体上,截短后的 C-糖基转移酶 MiCGTb(JMiCGTb)的 N-端含有 His-tag标签和 TEV酶切位点,构建的pET28-JMiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。 3、构建的 pET28-JMiCGTb载体在 B834表达宿主中表达,获得含有稀有元素硒的蛋白,用于异常散射实验获得实验数据4使用初筛结晶试剂盒筛选蛋白结晶的条件,初筛试剂盒为 HamptonⅠ、HamptonⅡ、CRYO1和 CRYO2两个产品的试剂盒,互相弥补彼此之间缺失的结晶条件。初筛和复筛均是采用的16孔悬滴法,经过大量的初筛、复筛以及条件优化最终得到了相对较好的JMiCGTb晶体。 结果:1、优化MiCGTb C-糖基转移酶的表达菌株,采用不同的表达宿主,得到高表达 MiCGTb的菌株。 2、通过采用不同的纯化手段,最终获得高纯度的 C-糖基转移酶MiCGTb可溶性蛋白。 3、获得C-糖基转移酶MiCGTb的单晶以及X-Ray衍射数据。 结论:1、获得高表达的截短的 C-糖基转移酶 MiCGTb表达菌株。 2、获得高纯度的截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白。 3、获得截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶。 4、获得一组6埃的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶X-Ray衍射扫描数据。