论文部分内容阅读
目的 本课题组在前期已经成功建立了卵巢癌的裸鼠顺铂耐药模型,得到顺铂获得性耐药卵巢癌细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,然后成功构建了CRABP2基因过表达的顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用]mcherry红色荧光标记。检测CRABP2基因过表达后对卵巢癌微环境中细胞因子的影响以及CRABP2基因过表达逆转卵巢癌细胞铂类耐药在动物模型中的表达验证,探讨CRABP2基因过表达后对细胞凋亡与细胞周期信号通路的影响。另外,建立SKOV3/DDPⅢ与间皮细胞,成纤维细胞三维共培养模型更好地模拟卵巢癌细胞的生长微环境,对三维共培养方法进行初探。为寻找逆转卵巢癌顺铂耐药的新的靶点奠定基础。方法利用课题组前期已经成功建立的顺铂获得性卵巢癌耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ和亲本顺铂敏感细胞株SKOV3-GFP,分别种植在裸鼠皮下待其成瘤后分次顺铂体内干预,实时荧光定量PCR检测细胞因子的动态表达变化。利用CRABP2基因过表达的顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2和空载对照组细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-mcherry,分别种植在裸鼠皮下待其成瘤后分次顺铂体内干预,Western Blot检测CRABP2基因过表达后对移植瘤下游Fas细胞凋亡信号通路上节点基因的蛋白表达和周期调控相关蛋白表达的影响。同时进行实时荧光定量PCR检测细胞因子的动态表达变化。采集人腹腔大网膜标本,分离纯化得到间皮细胞和成纤维细胞。利用Transwell小室,间皮细胞,成纤维细胞,SKOV3/DDPⅢ搭建三维共培养模型,底层为成纤维细胞,中层为间皮细胞,上层为SKOV3/DDPⅢ利用Clarity法包埋成去脂透明的高通透性立体模型,利用免疫荧光法观察三维共培养模型并进行三维成像。结果QRT-PCR的结果表明：注射顺铂药物后,敏感组表达高于耐药组的细胞因子有22个：敏感组表达低于耐药组的细胞因子有5个。在过表达CRABP2基因和其空载对照组中,注射顺铂药物后,空载对照组表达低于过表达CRABP2组的细胞因子有20个；空载对照组表达高于过表达CRABP2组的细胞因子有7个。注射顺铂药物后,空载对照组表达高于过表达CRABP2组中有4个细胞因子与注射顺铂药物后的敏感组表达低于耐药组的细胞因子相同,过表达CRABP2组表达高于空载对照组中有19个细胞因子与敏感组表达高于耐药组的细胞因子相同。因此,过表达CRABP2基因通过影响肿瘤的微环境来逆转卵巢癌的铂类耐药。相对于SKOV3-GFP/DDPII和空载对照组的SKOV3-GFP/DDPII-mcherry细胞株的裸鼠皮下移植瘤而言,过表达CRABP2的SKOV3-GFP/ DDPII-CRABP2细胞株的裸鼠皮下移植瘤的细胞周期被抑制,细胞凋亡途径被激活：随顺铂注射次数的增加,Fas信号转导通路上的Fas, FADD, Caspase9和Caspase3在过表达CRABP2移植瘤组织中的蛋白质表达相对于耐药移植瘤组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出上调趋势(P<0.05),而PARP1则在过表达CRABP2移植瘤组织中蛋白质表达相对于耐药组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出下调趋势(P<0.05)；随着顺铂次数的增加,细胞周期的依赖性蛋白激酶CDK6, CDK4和细胞周期蛋白cyclinDl在过表达CRABP2移植瘤组织中的蛋白质表达相对于耐药移植瘤组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出下调趋势(P<0.05),而细胞周期阻断剂p27 kip1则在过表达CRABP2移植瘤组织中蛋白质表达相对于耐药组织和它的空载对照移植瘤组织呈现出上调趋势(P<0.05)。即过表达CRABP2基因后的卵巢癌顺铂耐药细胞恢复了对顺铂的敏感性。三位共培养模型免疫荧光观察上层为SKOV3/DDPIII,中间为间皮细胞,下层为混有成纤维细胞的基质胶。结论过表达CRABP2后可使耐药的卵巢癌细胞恢复对顺铂的敏感性,影响肿瘤的微环境抑制细胞周期中的G1/S期、激活Fas凋亡信号通路的作用来逆转卵巢癌耐药。这给临床上逆转卵巢癌铂类耐药的治疗提供了新的靶点和理论基础。并且利用三维共培养模型可以更好地模拟卵巢癌细胞的生长微环境来研究肿瘤微环境对铂类耐药的影响。