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乳酸是重要的工业有机酸,在多个领域有着广泛的应用。乳酸根据旋光性的不同,分为D-乳酸和L-乳酸两种。本研究以提高产量为目的,分别用分子生物学和发酵学的方法,对D-乳酸脱氢酶的表达和L-乳酸的发酵生产进行了初步研究,为下一步实验打下基础。
本实验尝试使用基因敲除方法,破坏鼠李糖乳杆菌染色体中的D-乳酸脱氢酶基因,阻断D-乳酸代谢途径,从而提高L-乳酸产量。首先从鼠李糖乳杆菌原始菌株中克隆出D-乳酸脱氢酶基因,通过与载体pSE380和pET22b连接,构建了重组质粒,转化入大肠杆菌表达宿主B121中实现了D-乳酸脱氢酶的表达。酶活力检测和蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果都验证了结果正确。然而基因敲除实验没有成功,但本实验为后续实验打下了基础。
本研究通过对鼠李糖乳杆菌原始菌株进行紫外诱变和钴60诱变,筛选得到一株高效产L-乳酸的诱变菌株鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60,并以甘蔗糖蜜为主要原料,探索用此诱变菌株发酵生产L-乳酸的可能性。通过设置单因素实验,对该诱变菌株的发酵条件做了初步研究。实验结果表明,诱变菌株鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60在初始糖蜜浓度为20%(w/v)、加入4%(w/v)固体碳酸钙作为pH调节剂、接种量为6%(v/v).等发酵条件下,于37℃下发酵40小时,可最高产出106g/L的L-乳酸。此外,本研究发现,利用甘蔗糖蜜配制的发酵培养基还具有发酵液保持液态而不凝结的特点,更有利于产物的分离。因此,本研究的结果显示,利用廉价的甘蔗糖蜜为原料来生产重要的工业有机酸L-乳酸完全可行。本研究的结果展现了较高的工业应用价值,为后期工业生产提供了理论依据。