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研究背景结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,它是起源于结肠上皮细胞恶性程度极高的肿瘤,据癌症数据分析显示,结肠癌在全球发病率和死亡率居各种恶性肿瘤前列,其侵袭、转移是影响患者预后的重要因素,也是造成高致死率的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤动态的过程,肿瘤细胞会迁出血管随后散布至远端的器官,上皮-间质转化(EMT)是肿瘤转移中很重要的一个启动步骤,会严重影响到结肠癌细胞的转移能力,所以,研究结肠癌细胞EMT发生的分子机制或许会对医治结肠癌提供新的方向与思路。大量研究证明,肿瘤细胞的EMT过程与细胞骨架的重塑密切相关,还涉及多种信号通路的协同调控,特别是调控EMT的关键转录因子与miRNA相互作用,调控肿瘤EMT进程,对其机制的研究已经成为肿瘤转移分子机制领域的热点之一。蛋白4.1作为膜骨架蛋白连接关键分子,在调控肿瘤EMT进程中起到重要作用,与肿瘤发生、侵袭和转移存在密切关系。蛋白4.1N是蛋白4.1家族成员之一,且与多种肿瘤转移相关。有研究者在肺癌细胞中高表达蛋白4.1N,结果表明肺癌细胞中多种EMT相关标识物蛋白的表达都随之发生了改变。综上所述蛋白4.1N可能参与肿瘤细胞EMT的调节进而影响肿瘤转移的过程,但发生机制未明确研究,仍有待探讨。因此,探讨4.1N调控EMT的分子机制对于深入了解结肠癌转移具有重要的意义。研究目的通过研究蛋白4.1N在结肠癌EMT过程中与多种重要分子之间的调控关系初步阐明其在结肠癌转移中的调控作用及生物学意义。研究方法1.筛选蛋白4.1N在结肠癌细胞HT29和RKO中的表达情况;构建外源表达4.1N的RKO细胞系,并检测4.1N表达情况。2.检测蛋白4.1N对结肠癌细胞中EMT标志分子(E-cadherin、Vimentin)、EMT相关转录因子(ZEB、Snail、Twist)、基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。3.检测蛋白4.1N对RKO细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。4.miRNA-seq技术检测蛋白4.1N对RKO细胞中EMT相关的miRNA分子表达差异并用qRT-PCR对候选miRNA(miR-200s)表达量进行检测。5.检测蛋白4.1N对RKO细胞中Raf-MEK-ERK通路的影响,初步探索蛋白4.1N与RhoA的相互作用;加入ERK蛋白通路抑制剂并检测EMT相关miRNA、EMT标志Marker、转录因子、效应蛋白的变化。6.利用miR-200s mimics或inhibitor,检测蛋白4.1N表达量以及EMT标志分子、转录因子表达变化。7.在BALB/c裸鼠上建立皮下移植瘤及肺转移模型,统计皮下瘤大小、生长曲线,肺部表面转移瘤结节大小、数目,利用HE染色和免疫组织化染色分析EMT相关标志分子的表达变化,以明确4.1N对结肠癌侵袭和转移的作用。研究结果1.蛋白4.1N在HT29中表达正常,在RKO中出现缺失。构建了真核表达载体pEGFP-C3-4.1N,并成功转入RKO细胞中,在mRNA及蛋白水平均验证出转染后的RKO细胞表达4.1N。2.外源表达蛋白4.1N后,结肠癌细胞RKO中上皮型标志分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)出现明显上调,间质型标志分子波形蛋白(Vimentin)、EMT效应蛋白基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9出现明显下调。3.蛋白4.1N对结肠癌细胞RKO的体外增殖、迁移及侵袭具有抑制作用。4.外源表达蛋白4.1N后,结肠癌细胞RKO中miR-200b、c表达显著升高,转录因子ZEB表达明显下调。同时转染miR-200家族inhibitor后,EMT标志分子及效应蛋白表达差异被抑制。我们进一步转染miR-200s mimics后,发现4.1N表达无明显变化。5.外源表达蛋白4.1N后,Raf-MEK-ERK信号通路中蛋白磷酸化水平受到抑制,加入ERK抑制剂U0126后,EMT相关转录因子ZEB表达受到抑制,miR-200b/c表达上调。经初步机制分析,4.1N与RhoA蛋白存在相互作用。6.BALB/c裸鼠结肠癌皮下移植瘤及肺转移模型结果显示蛋白4.1N对结肠癌皮下移植瘤的生长和肺转移具有一定的抑制作用。研究结论蛋白4.1N对结肠癌细胞RKO的增殖、迁移具有抑制作用,并且能够通过与RhoA相互作用抑制Raf-MEK-ERK信号通路进而影响miR-200与转录因子ZEB的负反馈调节环路抑制RKO细胞的EMT进程,从而抑制肿瘤细胞的转移,而miRNA对4.1N并无反馈调节作用。体内实验再次验证了蛋白4.1N能够抑制结肠癌皮下移植瘤的生长、降低结肠癌细胞的肺转移能力。