目的从人骨肉瘤细胞株MG63细胞中分选及鉴定骨肉瘤类肿瘤干细胞。方法1.用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养MG63细胞，铺满细胞培养瓶底后传代；2.用含EGF（10ng/ml）、b-FGF(10ng/ml)及N2添加物的DMEM/F12无血清培养基及超低粘附细胞培养板悬浮培养MG63细胞，培养7-12天后，可形成50个以上细胞组成的骨肉瘤细胞球，将骨肉瘤细胞球吹散，重新加入无血清悬浮培养基中，观察是否再次成球；将骨肉瘤细胞球重新接种到含血清培养环境中，观察其生长情况；3.收集人骨肉瘤MG63细胞及无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用流式细胞仪检测比较MG63细胞及骨肉瘤细胞球中CXCR4及干细胞相关表面标志CD44、CD133的表达比例；4.收集人骨肉瘤MG63细胞及无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用CCK-8法检测比较MG63细胞及骨肉瘤细胞球在含EGF（10ng/ml）、b-FGF(10ng/ml)及N2添加物的DMEM/F12无血清培养基中第1-7天的生长情况，绘制生长曲线；5.收集人骨肉瘤MG63细胞及无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用成骨诱导培养基诱导细胞分化，4周后用茜素红染色法观察比较两种细胞分化情况；6.收集人骨肉瘤MG63细胞及无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用成软骨诱导培养基诱导细胞分化，2周后用甲苯胺蓝染色法观察比较两种细胞分化情况；7.收集人骨肉瘤MG63细胞及无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用成脂诱导培养基诱导细胞分化，4周后用油红O染色法观察比较两种细胞分化情况。结果1.无血清悬浮培养法培养骨肉瘤MG63细胞，7-12天后可形成50个以上细胞组成的骨肉瘤细胞球，将细胞球吹散传代，4-6天后可再次形成骨肉瘤细胞球，将骨肉瘤细胞球重新接种到含血清培养环境中，有分化的骨肉瘤细胞向细胞球周围呈放射状爬出；2.骨肉瘤MG63细胞中CXCR4表达比例为19.41±2.11%，CD44表达比例为34.92±3.73%，CD133表达比例为31.26±2.11%；骨肉瘤细胞球中CXCR4表达比例为68.60±2.71%，CD44表达比例为82.79±3.95%，CD133表达比例为71.58±1.53%；3.在含EGF（10ng/ml）、b-FGF（10ng/ml）及N2添加物的DMEM/F12无血清培养基中骨肉瘤细胞球从第三天开始生长速度开始超过骨肉瘤MG63细胞；4.骨肉瘤细胞球在成骨诱导条件下有钙结节形成，成功诱导细胞成骨分化，骨肉瘤MG63细胞无钙结节形成，未见细胞成骨分化；5.骨肉瘤细胞球在成软骨诱导条件下有软骨细胞特异性分化指标蛋白多糖形成，成功诱导细胞成软骨分化，骨肉瘤MG63细胞无蛋白多糖形成，未见细胞成软骨分化；6.骨肉瘤细胞球在成脂诱导条件下有脂滴形成，成功诱导细胞成脂分化，骨肉瘤MG63细胞无脂滴形成，未见细胞成脂分化；结论无血清悬浮培养法培养骨肉瘤MG63细胞形成的骨肉瘤细胞球具有自我更新、无限增殖、多向分化等干细胞特性，并高表达干细胞相关表面标志CD44、CD133，经鉴定成功从人骨肉瘤MG63细胞中分离骨肉瘤类肿瘤干细胞；转移性相关指标CXCR4在骨肉瘤类肿瘤干细胞中的表达显著高于骨肉瘤MG63细胞。第二部分CXCL12/CXCR4生物轴调控骨肉瘤类肿瘤干细胞侵袭与转移目的探讨CXCL12/CXCR4生物轴对骨肉瘤类肿瘤干细胞侵袭与转移的影响。方法1.用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养MG63细胞，铺满细胞培养瓶底后传代；2.用含EGF（10ng/ml）、b-FGF（10ng/ml）及N2添加物的DMEM/F12无血清培养基及超低粘附细胞培养板悬浮培养MG63细胞，培养7-12天后，可形成50个以上细胞组成的骨肉瘤细胞球；3.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组（浓度梯度为0、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml）；CXCL12（40ng/ml）+AMD3100（浓度梯度为0、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）刺激组：AMD3100预孵育2小时后，加CXCL12刺激细胞；2组刺激时间均为48小时，用流式细胞仪检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球细胞周期的影响；4.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组、CXCL12+AMD3100刺激组（浓度梯度同上），刺激48小时后，用CCK-8法检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球增殖能力的影响；5.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组、CXCL12+AMD3100刺激组（浓度梯度同上），刺激48小时后，用Transwell法检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球侵袭能力的影响；6.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组、CXCL12+AMD3100刺激组（浓度梯度同上），刺激48小时后，用Elisa法检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球血管内皮生长因子VEGF分泌能力的影响；7.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12（浓度梯度为0、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml）+表柔比星（1.0μg/ml）刺激组、CXCL12（40ng/ml）+AMD3100（浓度梯度为0、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml，预孵育2小时）+表柔比星（1.0μg/ml）刺激组，刺激48小时后，用流式细胞仪检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球化疗敏感性的影响。8.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将1×107个细胞分别接种于4组6-8周大小雄性BALB/c裸鼠皮下，每组3只：空白对照组（不用药物刺激，尾静脉及腹腔注射同实验组等量的无菌PBS）、CXCL12刺激组（0.5μg/Kg，隔天尾静脉注射一次，腹腔注射同AMD3100组等量无菌PBS）、AMD3100刺激组（1mg/Kg，每天腹腔注射一次，尾静脉注射同CXCL12组等量无菌PBS）、CXCL12（0.5μg/Kg，隔天尾静脉注射一次）+AMD3100刺激组（1mg/Kg，隔天注射一次），刺激6周，每周测量移植瘤大小，根据公式：V=π/6×长×宽×高计算体积，检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球裸鼠致瘤能力的影响；9.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组（浓度梯度为0、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml）；CXCL12（40ng/ml）+AMD3100（浓度梯度为0、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）刺激组：AMD3100预孵育2小时后，加CXCL12刺激细胞；2组刺激时间均为48小时，用实时荧光定量PCR（Real-time RT-PCR）检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球细胞转移性相关指标CXCR4、MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表达的影响；10.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，将细胞分为2组：CXCL12刺激组、CXCL12+AMD3100刺激组（浓度梯度同上），刺激48小时后，用蛋白质印迹法（Western blot）检测比较CXCL12及AMD3100对骨肉瘤细胞球转移性相关指标CXCR4、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响。结果1.细胞周期检测，CXCL12刺激组细胞S期所占比例增大，且随浓度梯度升高，S期所占比例增大越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；2.增殖能力检测，CXCL12刺激组细胞增殖能力升高，且随浓度梯度升高，促进增殖作用越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；3.侵袭能力检测，CXCL12刺激组细胞侵袭能力升高，且随浓度梯度升高，促进侵袭作用越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；4. VEGF分泌能力检测，CXCL12刺激组细胞VEGF分泌升高，且随浓度梯度升高，VEGF分泌升高越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；5.化疗敏感性检测，CXCL12+表柔比星刺激组细胞凋亡比例降低，且随浓度梯度升高，细胞凋亡比例降低越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；6.裸鼠致瘤能力检测，CXCL12刺激组成瘤速度快，体积大，1.0mg/Kg AMD3100对0.5μg/Kg CXCL12的抑制作用明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；7. Real-time RT-PCR检测，CXCL12刺激组CXCR4、MMP-2、MMP-9、VEGF mRNA表达升高，且随浓度梯度升高，mRNA表达升高越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；8. Western blot检测，CXCL12刺激组CXCR4、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高，且随浓度梯度升高，蛋白表达升高越明显，AMD3100可抑制CXCL12的刺激作用，且随AMD3100浓度梯度升高，抑制作用更为明显，与对照组有明显差异(P<0.05)；结论CXCL12/CXCR4生物轴调控骨肉瘤类肿瘤干细胞增殖、侵袭、VEGF分泌、化疗敏感性、致瘤性及转移性相关基因与蛋白的表达，可能在骨肉瘤类肿瘤干细胞侵袭与转移过程中发挥重要作用。第三部分CXCL12/CXCR4生物轴调控骨肉瘤类肿瘤干细胞作用机制研究目的对CXCL12/CXCR4生物轴调控骨肉瘤类肿瘤干细胞侵袭与转移的作用机制进行初步探讨，为骨肉瘤的临床治疗提供可能的靶向指标。方法1.用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养MG63细胞，铺满细胞培养瓶底后传代；2.用含EGF（10ng/ml）、b-FGF(10ng/ml)及N2添加物的DMEM/F12无血清培养基及超低粘附细胞培养板悬浮培养MG63细胞，培养7-12天后，可形成50个以上细胞组成的骨肉瘤细胞球；3.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，用CXCL12（40ng/ml）刺激骨肉瘤细胞球，刺激时间分别为0，5分钟，15分钟，30分钟，60分钟，120分钟，另设两组用AMD3100（1μg/ml，10μg/ml）预孵育2小时后，加CXCL12（40ng/ml）刺激30分钟，用Western blot观察比较PI3K/AKT信号通路与ERK1/2信号通路激活情况；4.收集无血清悬浮培养7-10天的骨肉瘤细胞球，分别用PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002（浓度梯度为0，5μM,10μM，20μM）与ERK1/2信号通路特异性抑制剂PD98059（浓度梯度为0，5μM,10μM，20μM）预孵育30分钟，加CXCL12（40ng/ml）刺激30分钟，用Western blot观察比较PI3K/AKT信号通路与ERK1/2信号通路激活情况；结果1．用CXCL12（40ng/ml）刺激骨肉瘤细胞球，从5分钟开始p-AKT蛋白与p-ERK1/2蛋白表达逐渐增强，于30分钟达到最强，总AKT与总ERK1/2蛋白表达随作用时间变化不明显，1μg/mlAMD3100即可抑制CXCL12对p-AKT蛋白与p-ERK1/2蛋白的刺激作用，并且随着AMD3100的浓度升高，抑制作用更加明显；2．LY294002与PD98059可抑制CXCL12对p-AKT蛋白与p-ERK1/2蛋白的刺激作用，并且随着LY294002与PD98059的浓度升高，抑制作用更加明显；结论CXCL12/CXCR4生物轴可能通过PI3K-AKT信号通路和ERK1/2信号通路促进骨肉瘤类肿瘤干细胞侵袭与转移。