研究背景与目的宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤,每年新发病例约13万,占世界总发病数28%,每年约2万女性死于宫颈癌。宫颈癌最主要的病原学原因是人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染。而只有一小部分女性感染高危型HPV将发展癌前病变,即宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈癌。HPV主要的致病原因是E6、E7癌基因整合至宿主DNA内,导致p53和pRB两个抑癌基因失活。然而,在宫颈癌的发生发展过程中,仅HPV感染并不足以引起宫颈癌,基因的异常调控、细胞的异常代谢、基因组的不稳定性等同样发挥重要作用。自噬是广泛存在于真核细胞内的II型程序性细胞死亡,细胞在应激情况下,如缺氧、生长因子水平改变、暴露于细胞毒性环境,自噬会被上调。自噬与肿瘤发生发展密切相关,在肿瘤发生发展过程中的作用具有两面性,一方面,自噬可以作为肿瘤抑制因子抑制肿瘤的发生,另一方面,自噬可以促进肿瘤发生发展。自噬相关蛋白ATG12是ATG12基因编码的一种蛋白。在哺乳动物细胞中ATG12与ATG5形成复合物,在自噬的形成中发挥至关的重要。研究表明,自噬相关蛋白,如Beclinl,参与宫颈癌的发生、发展,在宫颈癌的发生发展中发挥重要的作用。然而ATG12在宫颈癌及癌前病变中的作用尚不明确。本研究的目的:(1)检测ATG12在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变组织及宫颈癌组织中的表达及临床意义;(2)探索ATG12在预测宫颈锥切术后病变复发的价值;(3)在细胞分子水平探索ATG12的调控机制。第一部分自噬相关蛋白ATG12在宫颈病变组织中的表达及临床意义目的本研究的目的是检测ATG12在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变组织及宫颈癌组织中的表达及临床意义。材料与方法组织标本来源于2010年至2015年期间于莱芜市妇幼保健院确诊为宫颈癌并接受手术治疗(子宫切除或根治性子宫切除)后宫颈癌组织;行诊断性或治疗性宫颈锥切术或诊断为CIN行子宫切除术的宫颈病变组织;因妇科良性疾病(子宫肌瘤、子宫肌腺症)行子宫切除术的组织。利用免疫组织化学的方法检测ATG12在宫颈鳞癌标本、CIN1标本、CIN2-3标本、正常宫颈组织标本中的表达。统计分析两组之间率的比较采用Fisher确切概率法,采用Bonferroni方法来调整每个检验的检验水准,进行多组间样本率的两两比较,调整检验水准后p<0.008(0.05/6=0.008)为有统计学差异。研究结果共收集120例宫颈组织标本,进行了免疫组织化学染色(细胞浆着色为阳性,不着色为阴性)。结果发现ATG12主要表达在细胞浆,在30例正常宫颈组织中,28例阳性,阳性率为93.3%,30例CIN1组织中27例阳性,阳性率为90.0%,30例CIN2-3组织中16例阳性,阳性率为53.3%,30例宫颈鳞癌组织中仅7例阳性,23例阴性,阳性率为23.3%。CIN2-3和宫颈鳞癌组织ATG12阳性率均显著低于正常组织和CIN1组,正常组织和CIN1组无差异,CIN2-3和宫颈鳞癌无差异。小结我们的实验首次研究了 ATG12在宫颈癌及癌前病变中的差异表达,发现ATG12在CIN2-3和宫颈鳞癌中表达下降,提示ATG12参与了宫颈癌的发生发展,有望成为宫颈癌及HPV感染的治疗靶点。第二部分ATG12与宫颈锥切术后病变复发的相关性研究目的通过回顾性病例对照研究,寻找与宫颈病变持续或复发相关的因素,探索自噬相关蛋白ATG12在宫颈锥切术后病变持续或复发中的临床意义。材料与方法回顾性收集2009年1月至2015年12月于莱芜市妇幼保健院行宫颈锥切术的352例患者的临床病理特征及随访信息。术后3个月、6个月及12个月时复查TCT及HPV。此后,每6-12个月进行细胞学与HPV的联合检测。转诊阴道镜的指征是ASCUS及更严重的病变或HPV持续阳性超过1年。病变持续的定义是锥切术后半年之内活检证实的高级别CIN,病变复发的定义是半年以上活检证实的高级别CIN。以宫颈锥切术后病变残留或复发患者作为病例组,以同期在我院接受宫颈锥切术并随访2年无复发患者为对照组,按照病例组:对照组=1:1的比例进行匹配。选取病变持续或复发患者的初次锥切术组织标本蜡块及匹配组患者的初次宫颈锥切术的石蜡标本,采用免疫组化的方法检测ATG12在两组标本的表达。研究结果按照入选标准和排除标准进行筛选后,最终298名患者纳入本研究中。中位随访时间25个月,最短12个月,最长64个月。在随访期间共72人次转诊阴道镜检查。阴道镜暴露充分者共37例,占51.39%;暴露不充分者35例,占48.61%。61人次接受阴道镜下宫颈活检术。活检病理证实,共28例患者病理为CIN2-3,诊断为病变持续或复发。按照28例复发组为病例组,配对的28例未复发病例为对照组,比较两组的年龄、术后3个月HPV、宫颈锥切术切缘、ATG12表达情况,结果表明两组间年龄无差别。复发组HPV阳性率为89.3%(25/28),未复发组阳性率为35.7%(10/28),复发组HPV阳性率显著高于未复发组(p<0.001)。复发组ATG12表达阳性率为25%(7/28),未复发组ATG12表达阳性率为71.4%(20/28),未复发组ATG12表达阳性率显著高于复发组(p=0.001)。手术切缘阳性率复发组为28.6%(8/28),未复发组为3.6%(1/28),复发组手术切缘阳性率显著高于未复发组(p=0.025)。HPV阳性、ATG12表达的缺失和切缘阳性是宫颈病变锥切术后病变持续或复发的危险因素。HPV阳性的比值比(odds ratio,OR)= 15,95%可信区间(CI)=(3.7,61.1),ATG12表达缺失的OR值为7.5,95%CI(2.3,24.5),切缘阳性的 OR 值为 10.8,95%CI(1.2,93.4)。小结我们这项病例对照研究发现,术后HPV阳性、切缘阳性和ATG12蛋白表达缺失是宫颈病变持续或复发的高危因素。ATG12是与细胞自噬相关的重要蛋白,不仅参与细胞的自噬,还与细胞的凋亡、炎症反应等多个细胞活动有关。我们首次研究了 ATG12在宫颈病变随访中的作用。第三部分MiR-378通过调控ATG12促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭目的本部分的研究目的是探索ATG12的表观调控机制,探索ATG12与miR-378的相互作用及对宫颈癌细胞的作用和临床意义。材料与方法收集60例因良性妇科疾病行子宫切除术的正常子宫颈组织、70例CIN III组织及55例宫颈鳞癌组织标本。常规培养人子宫颈癌细胞系HeLa和C-33A细胞。利用TargetScan软件预测调控ATG12的miRNA,初步预测ATG12是miR-378的靶基因。构建小干扰RNA(si-ATG12)下调ATG12的表达;miR-378过表达慢病毒GIPZ-miR-378及mi R-378干扰病毒载体;实时荧光定量PCR检测ATG12 mRNA及miR-378的相对表达量;Western blot检测CCND1、磷酸化-Rb及ATG12蛋白的表达;双荧光素酶报告系统验证miR-378对ATG12的调控作用。研究结果通过Targetscan预测ATG12的调控miRNA,结果显示ATG12的3’UTR 449-455的位点与miR-378互补,荧光素酶报告分析结果显示,在HeLa和C33-A细胞中,miR-378可以抑制pmirGLO-ATG12-3’-UTR野生型转染细胞的荧光素酶活性,对pmirGLO-ATG12-3’-UTR突变型转染细胞无影响,同时,miR-378阴性对照对pmirGLO-ATG12-3’-UTR野生型转染细胞的荧光素酶活性无影响。表明,ATG12是miR-378直接靶基因,miR-378调控ATG12的表达。实时荧光定量PCR及Western Blot结果均显示,siRNA-ATG12可以显著抑制宫颈癌细胞系C-33A细胞ATG12的mRNA及蛋白的表达。Transwell小室模型实验结果显示,siRNA-ATG12组的侵袭和迁移能力显著高于阴性对照组。干扰RNA si-ATG12组C-33A细胞的侵袭和迁移能力显著高于对照组,提示ATG12可能抑制宫颈癌细胞的转移。实时荧光定量PCR结果显示,与正常宫颈组织相比,CIN3及宫颈鳞癌组织中miR-378的表达均显著升高(p<0.001),而CIN3组织与宫颈鳞癌组织中的表达无显著差异。对宫颈鳞癌进一步分组分析发现,伴有淋巴结转移癌的宫颈癌组织中miR-378的表达显著高于淋巴结转移阴性的宫颈癌组织(p<0.05)。成功构建miR-378的过表达和干扰慢病毒载体,miR-378过表达增强宫颈癌细胞系HeLa和C33-A细胞的体外迁移和侵袭能力,miR-378的下调抑制宫颈癌HeLa和C33-A细胞的迁移和侵袭能力。miR-378过表达的C-33A细胞中p-Rb、ATG12及CCND1蛋白的表达显著下降。同样,在miR-378 inhibitor组的HeLa细胞中,p-Rb、ATG12及CCNDI蛋白的表达显著高于阴性对照组蛋白的表达,提示miR-378可能通过p-Rb、ATG12及CCND1蛋白促进宫颈癌细胞体外的转移能力。小结ATG12是miR-378的功能靶标,miR-378促进宫颈癌细胞的侵袭和转移能力。本研究的结果表明,ATG12及miR-378可能为宫颈癌患者的治疗靶点,为宫颈癌发生和转移分子机制提供新的理论。研究结论1、ATG12表达在大部分正常组织和CIN1中,ATG12在CIN2-3和宫颈鳞癌组织的阳性率显著下降。2、ATG12表达的缺失,锥切术后HPV阳性和切缘阳性是宫颈锥切术后病变持续或复发的危险因素。3、ATG12是miR-378的功能靶标,miR-378可能通过调控ATG12促进宫颈癌细胞的侵袭和转移。