视神经脊髓炎谱系疾病（neuromyelitis optica spectrum disease,NMOSD）,是一类中枢神经系统（central nervous system,CNS）脱髓鞘性自身免疫性疾病,以视神经和脊髓受累为主。在全球范围内,该病发病率在0.73/100000人/年到10/100000人/年不等,非洲及亚洲高发,白种人较少。NMOSD好发于青年,女性明显占优势,女性和男性的发病率比例可高达9:1。受地域与种族的差异的影响,其临床特征也存在一定的差异。这些临床特征差异可能与个体易感性相关。自身免疫性疾病个体的易感性是由遗传因素和环境因素共同决定的。由于环境的影响,无法维持表观遗传内稳态,可能会导致在特定细胞中异常的基因表达导致细胞耐受性的丧失,然后被修饰的细胞有助于基因易感个体发生自身免疫疾病。众多研究表明,基因多态性在不同人群患NMOSD的易感性和进展中发挥着重要作用。因此,研究基因多态性和表观遗传学对理解NMOSD的病因非常重要。许多自身免疫性疾病在女性中发生率更高,这种女性优势的原因目前尚不十分清楚。有研究表明女性高发是由于她们具有两条X染色体所致。X染色体上包含大量免疫相关性基因,但有关X染色体上基因多态性与NMOSD的发病风险的关系研究较少。白细胞受体激酶1（IRAK1）是X染色体上非常重要的免疫相关基因,其基因多态性与多种自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎相关。金属蛋白酶-1组织抑制剂（TIMP1）是位于X染色体上另外一个非常重要的基因,其多态性等位基因在个体间特异性表达与多态性对表达产物的不同调控有关。迄今为止,大量的研究表明TIMP1含有多个常见的多态性位点与一些自身免疫性疾病有关。并且,有些功能性基因多态性位点改变了TIMP1基因产物的水平,参与了人类疾病的发生。然而这两个X染色体基因在NMOSD中的具体机制尚不明确。NMOSD的发病机制也尚不明确。近年来,随着水通道蛋白4（AQP4）抗体的发现,NMOSD逐渐从MS中分离出来,成为一个独立的疾病。研究表明NMOSD是淋巴细胞介导的体液免疫性疾病。目前普遍认为,在血清AQP4抗体阳性的NMOSD患者中,循环中产生的AQP4抗体为主要的致病抗体,通过破坏的血脑屏障,与星形胶质细胞终足上丰富表达的AQP4结合,激活补体,导致星形胶质细胞损伤、髓鞘脱失以及轴索损伤。但是,在临床上,AQP4抗体滴度与病情严重程度非线性相关,还有一部分NMOSD患者AQP4-Ig G呈阴性。然而,在NMOSD患者中,血脑屏障（BBB）破坏是共有的病理机制之一。临床研究表明BBB破坏的程度是预测NMOSD复发率和严重程度的临床标志物。动物实验也表明AQP4-Ig G免疫的血脑屏障完整的小鼠并不会导致神经损伤,而直接脑内注射或预先破坏血脑屏障的小鼠,在接受AQP4-Ig G免疫时,神经系统则出现类似NMOSD的脱髓鞘性炎性改变。由此可见,血脑屏障的破坏在NMOSD的发病机制的作用相当重要。有研究认为,在外周循环中T细胞激活后,可能通过体液免疫系统介导炎症过程。IRAK1是参与许多Toll样受体（TLRs）下游信号传递的关键激酶,磷酸化IRAK1从My D88形成的复合物中释放,激活下游信号,发挥致炎作用。研究表明,TLR炎症信号转导通路参与T细胞的激活与炎症因子的生成。IRAK1参与了多种自身免疫性疾病的发病过程,包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等,然而其在NMOSD中的作用机制尚不明确。另外,循环中的炎症细胞因子激活MMP-9通过降解细胞外基质可破坏血脑屏障。这些过程受到多种因素的调节。TIMP1是一种分泌型蛋白,可由人类外周血中性粒细胞和淋巴细胞产生,为MMPs（主要是MMP9）的天然抑制剂,通常以1:1的化学计量和可逆的方式抑制MMPs。MMP9/TIMP1不平衡,可能导致细胞外基质的蛋白水解增加,从而导致血脑屏障的破坏。目前,已有研究表明TIMP1和MMP9的表达分别在NMOSD患者的血清或脑脊液上调,可能通过介导血脑屏障的破坏参与了NMOSD的发病。由此推测,调控TIMP1表达的因素可能会进一步影响人类NMOSD的患病风险。TIMP1表达受遗传因素及表观遗传因素的双重调节。miR-363-5p可能是调控TIMP1表达的重要表观遗传因子。众所周知,micro RNA可在转录后水平调控靶基因表达而发挥生物学功能。miR-363-5p是一种新发现的小RNA,通过调控多种靶基因的表达,在神经损伤及自身免疫性疾病中发挥着生物学功能。有研究显示TIMP1是miR-363-5p的靶基因之一,其表达受miR-363-5p的调控,改变内皮细胞的功能和血管的生成。但是,这些因子在NMOSD中的作用尚不明确。综上所述,X染色体相关基因在NMOSD中的作用研究较少。X染色体基因TIMP1及IRAK1基因多态性与NMOSD的易感性及其血脑屏障破坏的关系也不十分明确。因此,本系列研究围绕NMOSD遗传及表观遗传学因素,进行了三个部分的探讨:第一部分通过基因测序的方法,探讨TIMP1、IRAK1基因多态性与中国汉族人群NMOSD易感性的关系,进一步分析两者与血脑屏障破坏的相关性。通过第一部分的结果,我们发现虽然两个基因多态性均与NMOSD的易感性存在一定的关系,但是TIMP1与血脑屏障破坏的关系更为明显,因此选择TIMP1作为研究因子进行后续的机制研究。第二部分通过测定急性期NMOSD患者TIMP1、MMP9及miR-363-5p的表达,评估他们在NMOSD急性期与血脑屏障破坏的关系,及其表达与TIMP1基因多态性的关系。第三部分验证了TIMP1是miR-363-5p的靶基因,明确在T细胞上,TIMP1的表达受miR-363-5p的负调控。第一部分X-连锁TIMP1、IRAK1基因多态性与视神经脊髓炎谱系疾病的相关性研究目的:本研究旨在评估中国汉族人群中X染色体TIMP1、IRAK1基因多态性与NMOSD的关系。方法:1.选取符合入选标准的视神经脊髓炎谱系疾病患者和健康对照组作为研究对象。2.所有研究对象,应用血液基因组提取试剂盒提取外周血白细胞DNA。利用SNaPshot方法检测了TIMP1（rs4898,rs2070584,rs6609533）及IRAK1（rs1059702、rs7061789、rs1059703,rs3027898）共7个单核苷酸多态性位点,并进行了基因分型,比较了NMOSD病例和对照组的等位基因、基因型和单倍型的频率,评估TIMP1、IRAK1基因多态性与中国北方汉族人群NMOSD易感性的关系。3.按年龄、性别、AQP4状态、Qalb状态和发病年龄进行分层分析。比较TIMP1（rs4898,rs2070584,rs6609533）单倍型与临床特征的关系。比较了IRAK1单倍型与NMOSD患者血脑屏障破坏的关系。结果:由于TIMP1和IRAK1两个基因均位于X染色体上,结果应该男女分开计算基因型的频率,受男性样本量过小的影响,本部分未计算男性人群中两个的基因型分布频率。1.在女性人群中,NMOSD患病组中TIMP1 rs4898-C、rs2070584-G、rs6609533-A等位基因频率低于健康对照组（所有n=287,P＜0.05）;在最优模型隐性模型下,NMOSD患病组人群rs4898-CC、rs2070584-GG和rs6609533-AA基因型的频率显著低于健康对照组（n=287,所有P＜0.05）。2.TIMP1 rs4898,rs2070584,rs6609533三个位点存在完全的连锁不平衡（D’＞0.98）。单倍型分析结果显示,在所有人群中,共检出了三种频率＞0.05的单倍型,其中单倍型T-T-G（rs4898-rs2070584-rs6609533）在NMOSD患病组中频率显著高于健康对照组,是NMOSD的风险单倍型（OR=1.547,95%CI=1.092～2.192,P=0.01）。单倍型T-T-G的频率在血脑屏障破坏组高于血脑屏障正常组（OR=2.41,95%CI=1.01～5.80,P=0.044）。3.IRAK1 A-G-A-A（rs1059703-rs1059702-rs3027898-rs7061789）在NMOSD中的分布频率明显低于健康对照组（OR=0.50,95%CI=0.31～0.81,P=0.0049）。IRAK1在NMOSD患者组中,血脑屏障正常组共发现6例（33.33%）携带IRAK1 A-G-A-A的单倍型,12例（66.67%）其他单倍型携带者,在血脑屏障破坏组中,有3例（27.27%）A-G-A-A单倍型携带者,8例（72.73%）其他单倍型携带者,差异无统计学意义（P=0.732）。小结:本部分实验我们探讨了X染色体基因TIMP1及IRAK1基因多态性与NMOSD的易感性相关。TIMP1 SNPs单倍型T-T-G（rs4898-rs6609533-rs2070584）不仅显著的增加了中国汉族女性人群NMOSD的发病风险,而且携带TIMP1单倍型T-T-G的NMOSD患者,血脑屏障破坏的风险增加,推测T-T-G可能通过改变TIMP1蛋白的表达水平,在NMOSD血脑屏障破坏的机制中发挥了作用。但是IRAK1单倍型与血脑屏障破坏无关。因此,选择TIMP1作为因子进行后续的机制研究。第二部分TIMP1、MMP9及miR-363-5p在视神经脊髓炎谱系疾病中的表达及其与血脑屏障破坏的关系目的:本研究旨在探讨TIMP1、MMP9及miR-363-5p在视神经脊髓炎谱系疾病中的表达及与血脑屏障破坏的关系,分析其与TIMP1基因多态性的关系。方法:1.选取急性期视神经脊髓炎谱系疾病患者和健康对照组。这部分患者为第一部分基因检测的患者中首次发作的患者,并且6个月内未应用激素、免疫调节剂等,未合并其他疾病。2.采用ELISA方法检测血浆TIMP1、MMP9的水平。3.qPCR法分别检测外周血单个核细胞TIMP1mRNA,血浆miR-363-5p水平。4.根据临床特征及TIMP1单倍型分组比较NMOSD组内TIMP1、MMP9及miR-363-5p表达差异,评估其在NMOSD中的作用。结果:1.TIMP1mRNA,血浆miR-363-5p在NMOSD患病组高于健康对照组（n=40,均P＜0.001）。同样,TIMP1和MMP9水平在NMOSD患病组也高于健康对照组（n=40,均P＜0.05）。NMOSD患者组MMP9/TIMP1比值略高于正常对照组,但差异未达到统计学意义（n=40,P＞0.05）。2.根据临床症状分层后,miR-363-5p在EDSS大于5分的NMOSD患者中的表达高于EDSS评分小于5分的NMOSD患者（n=30,P＜0.05）。3.MMP9/TIMP1比值在脑脊液白蛋白商增高的NMOSD患者组中的表达高于脑脊液白蛋白商正常的患者组（n=30,P＜0.05）。相关性分析显示MMP9/TIMP1比值与脑脊液白蛋白商呈中等程度的正相关（n=30,r=0.505,P=0.004）。4.在根据TIMP1单倍型分层分组后,在携带T-T-G（rs4898-rs2070584-rs6609533）风险单倍型的患者中,血浆TIMP1表达低于其他单倍型的患者（n=30,P＜0.05）,这种表达差异在女性患者中更加明显（n=25,P＜0.01）。TIMP1mRNA,MMP9/TIMP1比值、miR-363-5p表达差异未达到统计学意义（n=30,所有P＞0.05）。5.在NMOSD患者中,血浆miR-363-5p与PBMC中TIMP1 mRNA的相对表达量呈轻度负相关（n=30,r=-0.33,P=0.07）,而与血浆TIMP1蛋白的表达量呈中等程度的负相关（n=30,r=-0.5157,P=0.005）。小结:TIMP1m RNA、TIMP1、MMP9、miR-363-5p表达在视神经脊髓炎谱系疾病中升高,其中miR-363-5p可能与疾病的残疾严重程度有关,血浆MMP9/TIMP1比值可能发挥了破坏血脑屏障的作用。TIMP1风险单倍型T-T-G（rs4898-rs2070584-rs6609533）具有生物学功能,与TIMP1蛋白表达下降有关。血浆miR-363-5p和血浆TIMP1蛋白在NMOSD患者中表达呈负相关,提示TIMP1蛋白的表达可能受miR-363-5p的负调控。第三部分TIMP1基因表达受miR-363-5p的负调控目的:本部分旨在探讨TIMP1是miR-363-5p的靶基因,在T细胞中其表达受miR-363-5p负调控。方法:本部分研究选用H293T细胞进行靶基因的结合的验证。随后选用JURKA T作为研究对象,验证miR-363-5p与TIMP1的负调控关系。每个实验实施3次。1.双萤光素酶报告基因用于靶基因的验证。利用生物信息学方法获得质粒构建突变位点。构建质粒分组:空细胞组,正常对照组,TIMP13’UTR（WT）对照组,TIMP1 3’UTR（WT）组,TIMP1 3’UTR（hsa-miR-363-5p MUT1+MUT2）对照组,TIMP1 3’UTR（hsa-miR-363-5p MUT1+MUT2）组。利用以上质粒与hsa-miR-363-5p模拟物,萤光素酶、肾素和构建质粒共转染H293T细胞。使用萤光素酶测定系统（Promega）定量萤光素酶活性。2.慢病毒载体感染JURKA T细胞。分组:hsa-miR-363-5p模拟物正常对照组,hsa-miR-363-5p模拟物组,hsa-miR-363-5p抑制剂对照组,及hsa-miR-363-5p抑制剂组。利用上述质粒,通过慢病毒载体感染JURKA T细胞,利用qPCR检测TIMP1mRNA及MMP9 m RNA的表达,Western-Blot技术检测TIMP1、MMP9蛋白表达的变化。结果:1.TIMP1是miR-363-5p的靶基因。双萤光素酶报告基因结果显示与miR-363-5p NC相比,共转染TIMP1-3’-UTR（WT）和miR-363-5p模拟物的细胞中的相对荧光素酶活性显着降低,下降了27%（n=3,P＜0.0001）;共转染TIMP1-3’-UTR（MUT1+MUT2）和miR-363-5p模拟物的细胞中的相对荧光素酶活性高于共转染TIMP1-3’-UTR（WT）和miR-363-5p模拟物的细胞（n=3,P＜0.0001）。2.TIMP1受miR-363-5p的负调控。与转染miR-363-5p mimics对照的细胞相比,转染miR-363-5p模拟物的细胞中TIMP1的表达在m RNA和蛋白水平上均显著降低（n=3,P＜0.05）。MMP9的表达在mRNA和蛋白水平均无显著性差异（n=3,P＞0.05）。与转染miR-363-5p inhibitor对照的细胞相比,转染了miR-363-5p inhibitor的细胞中TIMP1m RNA的表达变化不显著,TIMP1蛋白表达轻度增加,但未达到统计学意义（n=3,P＞0.05）。MMP9的表达在m RNA及蛋白水平无显著性差异n=3,P＞0.05)。与转染miR-363-5p mimics对照的细胞相比,转染miR-363-5p模拟物的细胞中MMP9/TIMP1的表达上调（n=3,P＜0.05）,与转染miR-363-5p inhibitor对照的细胞相比,转染了miR-363-5p inhibitor的细胞中MMP9/TIMP1表达下调（n=3,P＞0.05）。小结:本部分研究证实,在T细胞上,miR-363-5p能特异结合TIMP1基因的3’UTR区,TIMP1是miR-363-5p的靶基因。miR-363-5p过表达可负调控TIMP1m RNA及TIMP1蛋白的表达,miR-363-5p沉默则可上调TIMP1mRNA及TIMP1蛋白表达。