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前言皮肤是被覆于人体表面的器官,与外界环境直接接触。皮肤具有复杂的抗氧化功能,决定氧化应激造成的损伤程度。皮肤的自然老化及外源性刺激可以使自身的抗氧化能力下降。紫外线（ultraviolet,UV）照射是引起皮肤抗氧化能力下降的一个因素。过度的UV照射造成细胞内活性氧基团增加,损伤皮肤内的脂质、蛋白和核酸,皮肤会出现红斑、水肿、增生、光老化、色素沉着、DNA损伤及免疫抑制,这些生物反应直接或间接地导致皮肤肿瘤的发生。近年来,由于人们生活方式的改变、户外活动增加以及大气臭氧层的破坏,由UV引起的疾病不断增多。动物和人体实验表明天然抗氧化剂如维生素C和E、大豆异黄酮、绿茶多酚、白藜芦醇及N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcystein,NAC）等能调节这些事件的启动和进展,减轻UV引起的皮肤损伤。这些提示在护肽品中或饮食中加入抗氧化剂可能阻止UV引起的皮肤炎症、老化,抑制肿瘤发生。但是,有些抗氧化剂如维生素C和E很不稳定,而有些如NAC要很高浓度才能起作用,而且,每种抗氧化剂都不能完全消除UV引起的光损伤。所以,有必要探索新的抗氧化剂,以增强抗光损伤的功效。檀香油（sandalwood oil）又名东印度檀香油,由檀香科植物白檀的木片或根、枝经水蒸气蒸馏所得。檀香油用于治疗炎症性皮肤病及皮肤护理已有数千年的历史。外用檀香油具有很强的杀菌效果,能抑制痤疮丙酸杆菌、皮肤癣菌的生长,抑制单纯疱疹病毒1型复制,并且对宿主细胞无细胞毒作用。它能刺激细胞的更新,有助于瘢痕、伤口、皱纹、痤疮以及其他皮肤病的愈合。因其疗效卓著,被称作“液体黄金”。檀香油能清除活性氧基团,有很强的抗氧化作用。Dwivedi等报道檀香油及其主要成分α-檀香醇涂抹小鼠皮肤后,能显著抑制化学致癌剂致皮肤肿瘤的启动和促进,减少肿瘤的数目。α-檀香醇亦能诱导人类表皮样细胞癌A431细胞凋亡。我们预期人体皮肤局部涂抹檀香油可以减轻UV照射引起的皮肤光损伤。但目前人体应用檀香油的有效性及安全性尚无报道。本研究的目的是通过在人体皮肤UVB照射前、后涂抹檀香油,比较出现红斑和不适反应程度、表皮内日晒伤细胞数目,分析基质金属蛋白酶-1（matrixmetalloproteinase,MMP-1）和MMP-9、白介素-10（interleukin-10,IL-10）和表皮内朗格汉斯细胞（Langerhans cells,LCs）数目及p53的表达等指标,来探讨局部涂抹檀香油对UVB引起的人体皮肤晒伤、光老化、光免疫抑制及光致癌性有无防护作用。方法1、志愿者:30名健康女性（年龄42～50岁,Fitzpatrick皮肤类型Ⅲ～Ⅳ型）,未患与光线有关的皮肤病,没有系统疾病;试验部位没有皮肤病;1个月内及实验过程中没有用药（包括非处方药）。签署知情同意书。其中15名取皮肤活检。2、最小红斑量（minimal erythema dose,MED）测定实验前测定每个志愿者的MED。在背部或臀部选择8个部位,分别以不同剂量UVB照射,以出现红斑的最小UVB剂量作为MED。3、UVB照射及檀香油涂抹:选择背部作为照射区域。UVB照射剂量为1.5-MED。分别于照射UVB前1小时或照射后5分钟涂抹1%檀香油、5%檀香油（溶于基质3:2的丙二醇:乙醇中）或基质;仅照射UVB、仅涂抹5%檀香油及不涂抹檀香油也不照射UVB作为对照。每个部位涂抹50μl檀香油溶液。照射UVB前将溶液轻轻擦去。4、红斑程度:红斑程度分级:0:无红斑;1:淡红斑;2:明显红斑;3:显著红斑或有浸润。照射后24小时由2名医生独立评估、照相。5、测定红斑指数（erythema index,EI）:分别于照射前、照射后24小时及7天后测定各部位的红斑指数,每个部位测5个点,取平均值作为该点的EI0、EI24h、EI7d。6、不适指数:采用5分法进行评分:正常皮肤感觉—1;轻度瘙痒—2;明显瘙痒—3;轻度疼痛—4;明显疼痛—5。7、皮肤活检:15例志愿者照射后24小时实验区域取皮肤活检,每块分成3～4份:分别福尔马林固定后石蜡包埋、OCT包埋-70℃冻存、立即浸于液氮中数秒后-70℃冻存、EDTA中浸泡4℃过夜后分离表皮。8、石蜡切片苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色:4μm厚石蜡切片贴于挂有多聚赖氨酸的载玻片上,HE染色。显微镜下观察表皮内日晒伤细胞,照相,计数400倍镜下5个视野内日晒伤细胞数目。计算15例志愿者的平均值±标准差。9、免疫组化:所有抗体都是小鼠抗人单克隆抗体（1）冰冻切片中MMP-1、MMP-9:抗体1:50稀释。（2）石蜡切片中p53表达:抗体1:100稀释。（3）新鲜表皮片中CD1a表达:解剖显微镜下分离表皮,置于Eppendorf管中与抗体反应。10、荧光Real-time定量RT-PCR检测皮肤活检中MMP-1、MMP-9mRNA水平-70℃冻存的组织块切片后应用RNAiso试剂盒提取总RNA,应用紫外分光光度计测定浓度和纯度,反转录,得到cDNA,荧光real-time quantitative PCR扩增。根据RNA浓度,反转录体系中加入的RNA模板量调至相同,以使得到的cDNA量一致。根据各样本内参照β-actin,对mRNA进行半定量分析。11、RT-PCR检测皮肤活检中IL-10 mRNA水平-70℃冻存的组织块切片后应用RNAiso试剂盒提取总RNA,测定浓度和纯度。根据RNA浓度,反转录体系中加入的RNA模板量调至相同,以使得到的cDNA量一致。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。用Labworks 4.0软件分析电泳条带,以IL-10与内参照GAPDH条带的密度比值表示IL-10 mRNA相对量。12、统计学分析:应用SPSS 13.0统计软件包进行ANOVA方差分析,以P＜0.05有统计学意义。结果1、红斑程度:30名受试者UVB照射的部位均出现了不同程度的红斑,涂抹檀香油照射UVB的部位红斑程度都减轻,5%檀香油防护效果强于1%檀香油。空白对照及仅涂抹檀香油的部位均无红斑出现。2、EI:UVB照射后24小时各部位照射EI值与肉眼观察的红斑程度一致。涂抹檀香油的部位EI值明显低于UVB照射及UVB/基质的部位。7天后,照射部位遗留色素沉着斑,红斑几乎消退,红斑指数下降,但仍显著高于照射前（P＞0.05）。3、不适指数:除空白对照及仅涂抹檀香油的部位无任何不适外,其余各处均有不同程度的瘙痒,2名志愿者仅UVB照射的部位及UVB/基质部位出现轻度疼痛。涂抹檀香油的部位不适指数为1者居多,5%檀香油的作用略强于1%檀香油。4、日晒伤细胞:UVB照射后表皮内出现日晒伤细胞,表现为胞核浓缩,胞浆嗜伊红染色。涂抹檀香油的部位表皮内日晒伤细胞数显著少于UVB/基质及仪照射UVB的部位（P＜0.05）,5%檀香油的作用强于1%檀香油（P＜0.05）,UVB照射前、后涂抹檀香油的作用没有显著性差异（P＞0.05）。5、MMP-1、MMP-9蛋白的表达:UVB照射后MMP-1、MMP-9的表达增加,檀香油涂抹对UVB引起MMP-1、MMP-9蛋白表达增高有抑制作用。涂抹檀香油的部位真皮内MMP-1、MMP-9表达量显著少于仅照射UVB的部位（P＜0.05）,与空白对照间差异很小（P＞0.05）。照射前、后涂抹檀香油的作用没有显著性差异。6、MMP-1、MMP-9 mRNA水平:UVB照射及UVB/基质的部位照射24小时后皮肤活检组织中MMP-1、MMP-9mRNA水平较空白对照部位显著升高（P＜0.05）,UVB照射前、后涂抹檀香油可以抑制MMP-1、MMP-9 mRNA水平（P＜0.05）,涂抹5%檀香油/UVB的部位mRNA水平与空白对照皮肤中接近（P＞0.05）。7、表皮片中CD1a+LCs数目:UVB照射24小时后,UVB及UVB/基质部位表皮片中CD1a+LCs较空白处显著减少（P＜0.05）。UVB照射前、后涂抹檀香油可以抑制UVB减少表皮内LCs的作用（P＜0.05）。涂抹5%檀香油/UVB的部位表皮片中LCs数量与空白对照表皮中相当（P＞0.05）。8、IL-10 mRNA水平:人体皮肤照射1.5-MED的UVB 24小时后,UVB与UVB/基质部位皮肤活检中IL-10 mRNA水平较正常皮肤中显著升高（P＜0.05）。檀香油抑制UVB诱导的IL-10mRNA的升高,5%檀香油作用强于1%檀香油（P＜0.05）。9、p53的表达:空白对照部位个别角质形成细胞核p53染色阳性,与UVB照射部位有显著性差异。涂抹基质前、后照射UVB部位p53阳性细胞数与仅UVB照射部位无明显差异。涂抹5%檀香油/UVB部位表皮内p53阳性细胞数显著少于仅UVB照射及UVB/基质部位（P＜0.05）。结论1、人体皮肤涂抹檀香油可以减轻UVB照射引起的皮肤红斑与不适,减少表皮内日晒伤细胞的形成。人体皮肤涂抹檀香油没有刺激性及过敏反应,安全性好。2、人体皮肤涂抹5%檀香油能抑制UVB照射引起的MMP-1和MMP-9mRNA及蛋白表达的升高,从而抑制光老化。3、人体皮肤照射UVB引起表皮内LCs数目减少及IL-10 mRNA水平升高,局部涂抹檀香油能保护表皮内的LCs,抑制IL-10水平升高,从而保护皮肤正常的免疫功能。4、人体皮肤局部涂抹檀香油能够抑制UVB引起的p53表达,在人体皮肤中具有抗光致癌的作用。5、UVB照射前、后涂抹檀香油有相同的功效,提示檀香油的光防护作用不是通过遮光起作用的。