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目的：类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是以慢性多关节滑膜炎,骨及软骨破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病。在我国是一种常见病、多发病。虽然目前其确切的发病机制尚不明确,但一般认为,自身反应性T细胞在局部的形成是该病重要的起动因素之一。近几年来的研究发现新的辅助性T细胞新亚群,主要有调节性T细胞和Th17细胞,在包括RA在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展中发挥重要的作用。本研究目的：建立调节性T细胞和Th17细胞的流式细胞术检测方法,探明RA时这两种新亚群在外周血中的分布特征；然后进一步分析导致该免疫状态的分子机制,明确Notch信号分子在RA外周血T细胞中的表达特性；最后再证实Notch信号可能通过参与辅助性T细胞的功能性分化介导关节炎的发生。通过本研究可望进一步明确RA的发病机制并为发展基于干预Notch信号的免疫治疗提供理论依据。方法：1、建立流式细胞术细胞内染色技术检测调节性T细胞和Th17细胞的方法。外周血单个核细胞表面分子标记后,再经固定/透膜处理进行细胞内染色,采用流式细胞术检测T细胞内FoxP3或IL-17。同时分析不同刺激剂对Th17细胞检测结果的影响。2、选取活动期及稳定期RA患者,采用流式细胞术细胞内染色技术检测外周血中调节性T细胞和Th17细胞百分比。并应用定量PCR的方法,分别检测这两种细胞特异的转录因子FoxP3与RORγt的mRNA表达水平。并与正常人结果进行比较。3、RA患者同时检测调节性T细胞和Th17细胞百分比,计算Th17/Treg比值。同时采用流式芯片技术检测血清中11种细胞因子,观察外周血中细胞因子微环境特征,并分析与Th17/Treg比值的相关性。4、采用流式细胞术检测RA外周血T细胞Notch受体分子的表达。应用免疫磁珠分离纯化外周血T细胞,通过定量PCR的方法检测Notch受体及靶基因的mRNA表达水平。应用Western Blot检测T细胞内Notch胞内段(Notch intra-cellular domain, NICD)核移位。5、采用Ⅱ型胶原加弗氏完全佐剂免疫DBA/1J小鼠,取脾脏单个核细胞体外培养,同时加入Ⅱ型胶原,从而建立胶原特异的体外增殖系统。采用多种方法包括：Notch信号非特异的阻断剂DAPT、Notch受体的单克隆抗体、Notch配体的融体蛋白来干预胶原特异的体外增殖反应,观察对T细胞增殖及Th1和Th17极化的影响。结果：1、FoxP3分子主要表达于CD4+T细胞,尤其是高表达CD25的CD4+T细胞,达97%左右。同时中等程度表达CD25的细胞中也含有少量FoxP3阳性细胞。T细胞活化后,表达FoxP3的CD4+CD25+T细胞比例显著增高,流式细胞术检测结果与定量PCR结果一致。2、RA患者CD4和CD25双阳性细胞所占比例与对照组没有明显差异,而活动期患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25+FoxP3+细胞明显低于稳定期和对照组(p<0.05)。活动期RA患者外周血CD3+CD8- IL-17+细胞(Th17细胞)明显多于稳定期,二者均多于正常对照组(P<0.05)。RA患者外周血Th1细胞呈现与Th17细胞类似的分布特点。3、稳定期组Th17/Treg比值(0.29±0.13)明显高于健康对照组(0.11±0.4)。活动期组Th17/Treg比值增加更为明显,达1.31±0.5。稳定期患者血清中Thl和Th17相关细胞因子明显增多,如IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-1β和TNF-α(P<0.05)。但稳定期组此类因子水平又低于活动期组(P<0.05)。与对照组相比,血清IL-4,IL-5,IL-10水平在稳定期组及活动期组均明显升高,但两疾病组间没有明显差异(P>0.05)。三组间血清IL-8,TNF-β水平未见明显差异(P>0.05)。Th17/Treg比值与血清IFN-γ(r=0.650, P<0.05), IL-6 (r=0.813, P<0.01), IL-1β(r=0.713,P<0.01),和TNF-α(r=0.6263,P<0.05)均呈显著正相关。4、与正常人相比,RA患者T细胞Notch 2、Notch3及Notch 4表达量增加(P<0.01),其中Notch 3主要表达于活化的T细胞,而Notch 1水平在二者间未见明显差异。全细胞NICD水平在RA活动期、稳定期及对照间无明显差异,但活动期组细胞核中的NICD水平明显高于后两者,即出现明显NICD核移位5、胶原特异性体外增殖体系中分泌Th1细胞和Th17细胞百分比明显增加(P<0.05)。刺激前后调节性T(CD4+CD25+FoxP3+)百分比未见明显变化(P>0.05)。胶原再次刺激可诱导CD4+T细胞Hes1 mRNA表达水平增加。Notch3受体分子mRNA水平也明显增加,但其它三种受种分子未见明显变化。DAPT和Notch3的单克隆抗体均能抑制胶原特异性T细胞增殖及向Th1和Th17方向分化。Delta-like 1融合蛋白促进胶原特异性T细胞向Th1和Th17方向分化,未影响到调节性T细胞的百分比。结论：1、类风湿性关节炎患者外周血存在Treg/Th17失衡,调节性T细胞(Treg)百分比下降,而Th17细胞比例明显增加,呈现向Th17细胞优势极化的格局。2、流式细胞术细胞内染色技术可在单细胞水平检测调节性T细胞和Th17细胞,转录因子FoxP3可作为调节性T细胞的检测标志物。3、类风湿性关节炎患者外周血中Thl和Th17相关的细胞因子增多,这种细胞因子微环境可能与Th17细胞优势极化相关。4、类风湿性关节炎患者外周血T细胞内Notch信号呈显著活化状态。5、Notch信号通过特定受体与配体参与调节胶原特异性T细胞增殖与分化,基于干预Notch信号的免疫治疗可能是类风湿性关节炎治疗的新手段。