由于伦理道德等因素的限制，多种人类疾病的研究不能直接在人体进行，需要依赖于体内的动物实验。过去的几十年，相继有多种疾病模型被报道，并极大地推动了人类疾病的研究和药物开发。由于人类和动物免疫系统存在明显的遗传方面的不同，建立带有人类免疫系统的人鼠嵌合体将有助于在动物体内研究人类基础免疫和评价疫苗效果等应用研究。近年来，陆续报道了几种在小鼠体内重建人类免疫系统的动物模型，如将人的胎儿胸腺、胎肝和胎骨甚至成人的外周血造血干细胞移植到患有严重联合免疫缺陷综合征(severecombinedimmunodeficiencysyndrome，SCID)的小鼠体内，分别构建成SCIDhyTHy/Liv、SCIDhuBone、SCIDHuPBL等几种人鼠嵌合小鼠模型。其中，人外周血淋巴细胞(HuPBL)，具有来源方便，重建后的动物模型中T、B淋巴细胞都具有功能，并可以检测到人免疫球蛋白的存在的优点，因而更广受重视。 已经报道的几种人鼠嵌合小鼠模型各有千秋。早期的HuPBL-SCID模型，人淋巴细胞重建效率低下(大约0.1％)，很难用这样的模型分析抗原特异的细胞免疫或者体液免疫反应，因而大大降低了该模型的广泛应用。针对上述缺陷，人们试图增加淋巴细胞的输入数量、或者转输之前给予小鼠亚致死量的放射线照射，甚至转输细胞前注射抗ASGM1以清除小鼠体内NK细胞的排斥反应，来促进淋巴细胞重建效率。后来不同的研究小组又尝试使用人生长因子激素、IL-4或者IL-6作为刺激剂来改善重建效率，然而，这几种改进方法收效不是很明显，只能有限地促进人T淋巴细胞在SCID小鼠体内重建。因而，目前迫切需要一种改进方法来完善淋巴细胞在SCID/NOD-SCID小鼠体内重建，同时重建后的人淋巴细胞具有正常功能。本研究旨在通过应用造血相关的细胞因子(rhIL-15)刺激造血前体细胞，促进人PBL在NOD-SCID鼠体内重建，主要试图解决以下三个科学问题：建立新型HuPBL/NOD-SCID嵌合体模型，以推动该模型在科学实验中的进一步深入研究；深入了解rhIL-15在HuPBL/NOD-SCID重建中的作用；应用HuPBL/NOD-SCID嵌合模型进一步研究rhIL-12在HBV疫苗免疫中的佐剂效应。本研究获得的主要结果大致分为以下五个部分：一、rhIL-15促进HuPBL在NOD-SCID鼠体内重建 白细胞介素15(IL-15)具有多种生物学功能，已经被证明有促进多种造血能力，它可以促进NK细胞的分化、发育，促进T淋巴细胞的扩增；B细胞的发育、成熟等。这些结果表明IL-15是一种很强的促进造血干细胞分化、发育的细胞因子，它可能适合作为huPBL转输NOD-SCID小鼠后免疫重建的促进剂。我们采用HIV、HBV均为阴性的正常献血员血液，用密度梯度离心法(Ficolldensitygradientcentrifugation)分离外周血淋巴细胞，在转输前12-36小时，给NOD-SCID小鼠注射40-60μL抗ASGM1(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.Japan)，同时在转输前2-4小时，对NOD-SCID鼠用200cGy放射线进行照射。每只鼠腹腔注射5×107个HuPBL，细胞转输后第二天，受体鼠腹腔注射rhIL-151μg/只，然后每隔一天腹腔注射rhIL-151次，剂量相同，共计注射10次。通过实验，我们发现如果rhIL-15使用剂量过大(10μg/只)，会引起移植物抗宿主病(GVHD)的发生，小鼠会发生消瘦、皮肤损伤、甚至死亡，而使用剂量过低，没有很好的促进效果，最后选择的合适剂量为1μg/只鼠。我们用FACS技术检测了嵌合体小鼠淋巴器官中人淋巴细胞的重建情况，发现使用rhIL-15重建的小鼠比没有使用的小鼠，淋巴器官中人T淋巴细胞增加了11-80倍，而对B细胞、NK细胞的影响不明显。我们采用定量ELISA检测HuPBL/NOD-SCID嵌合鼠血清中人免疫球蛋白IgG、IgM的水平，发现rhIL-15可以明显提高免疫球蛋白的产生。上述实验说明rhIL-15可以促进人T淋巴细胞在NOD-SCID小鼠体内重建，且和使用的剂量有关。 二、rhIL-15促进人PBL从NOD-SCID小鼠的腹腔向淋巴器官定向转移 为了搞清rhIL-15促进人PBL在NOD-SCID中重建的机制，我们观测了不同时间点：第7、第14、第21、第28天，HuPBL/NOD-SCID腹腔、胸腺和脾脏内人T淋巴的数量变化，结果发现随着时间的延长，rhIL-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠腹腔中人T淋巴细胞的数量逐渐减少，而与之相对应的是，嵌合体小鼠的胸腺和脾脏等淋巴器官内人T淋巴细胞的数量却在不断增加，我们同时还检测了嵌合体鼠的非淋巴器官肺脏和小肠，没有发现人淋巴细胞的存在。这说明rhIL-15可以促进人T淋巴细胞从小鼠的腹腔向淋巴器官定向转移。 三、rhIL-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠体内的人T淋巴细胞具有功能 考虑人鼠嵌合模型是否建立成功除了要看人的淋巴细胞在小鼠体内的分布和表型以外，还要检测转输后的细胞功能是否正常。我们取IL-15免疫的HuPBL/NOD-SCID小鼠的淋巴结细胞，在体外用PHA刺激，检测细胞的增值效应。我们知道由于NOD-SCID小鼠体内没有T淋巴细胞的存在，而PHA又是T细胞的特异性促增值剂，如果实验中发生了细胞的增值，那一定是转输成功的人T细胞的扩增使然。实验结果证明IL-15处理的嵌合体小鼠，人T淋巴细胞在PHA刺激后的增值水平和正常供者的外周血T淋巴细胞没有什么明显差别。同时用定量ELISA方法测定细胞增值时的上清中IFN-γ、IL-2的水平，结果发现和正常对照外周血T细胞相比也没有多大差异。这些结果说明重建后的人T淋巴细胞具有正常的功能。 四、rhIL-12促进HBsAg疫苗的免疫效果 已知预防乙型肝炎最好的方法式是乙肝疫苗，然而乙肝疫苗的免疫预防的效果并不十分完美。有些人预防接种该疫苗后不能产生有效的抗乙肝的特异性抗体。对于这部分人来说，注射目前的乙肝预防疫苗对防止乙型肝炎感染没有多少意义。我们考虑寻找一种额外的佐剂来促进乙肝疫苗在人体中的免疫效果。目前IL-12作为细胞免疫的佐剂在动物体内已有报道，由于在临床研究中还不能开展，为了满足进一步的研究需要，我们在实验中引入了人鼠嵌合体模型。我们把人外周血PBL细胞在体外预先刺激后直接接种在NOD-SCID鼠脾脏内，然后用IL-12联合乙肝疫苗免疫嵌合体鼠。我们用定量ELISA技术检测了小鼠体内抗HBsAg特异性抗体，结果发现：IL-12明显提高了嵌合模型小鼠外周血中特异性抗HBsAgIgG、IgM的水平，进一步检测IgG的亚型发现，IL-12大大提高了小鼠血清中抗乙肝IgG2a抗体的水平，而特异性IgG1抗体产生还有一定程度的减少。实验的结果证明IL-12可以作为HBsAg疫苗的有效佐剂使用。 五、rhIL-12调节HuPBL/NOD-SCID嵌合鼠中人CD4+Th细胞向Th1状态的改变为了进一步了解IL-12联合HBsAg疫苗免疫后HuPBL/NOD-SCID体内细胞的状态变化，我们取嵌合体小鼠的淋巴细胞在体外用HBsAg抗原刺激，同时用FACS检测刺激后细胞变化情况，结果发现引起增值的主要是人CD4+Th细胞，而CD8+Th细胞和B细胞变化不太明显。与其同时我们还检测了细胞的培养上清中产生的细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10)的水平，结果发现rhIL-12联合免疫的嵌合体小鼠分泌的细胞因子以Th1型为主(IFN-γ，IL-2)，而Th2型细胞因子的分泌却有所下降(IL-4，IL-10)。这些结果表明rhIL-12加强了小鼠体内Th1状态，抑制了Th2状态。 综上所述，rhIL-15可以有效促进人T淋巴细胞在NOD-SCID体内重建，我们的发现提示重组人IL-15在免疫缺陷病和骨髓移植中有潜在的临床应用前景，它有利于促进T淋巴细胞的扩增和准确的定位。同时rhIL-12在huPBL/NOD-SCID体内可以作为HBsAg疫苗的佐剂应用，促进了疫苗免疫的效果。乙肝疫苗如果能联合rhIL-12使用，将能提高该疫苗的免疫效果，从而造福人类。