【摘 要】
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目的为了探索细胞外亲环蛋白A（cyclophilin A,CyPA）及端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其潜在机制,本课题将从动物实验和细胞实验两个方面展开研究。方法采用c57小鼠构建心肌缺血再灌注模型,使用小动物心电图验证造模成功,通过伊文思蓝-TTC染色评估心肌损伤面积,蛋白印迹法（Western blot
【基金项目】
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江苏省青年医学重点人才培养项目（QNRC2016843）； 江苏省“六大人才高峰”高层次人才选拔培养资助计划（WNS-045）； 镇江市科技创新资金（创新能力建设计划——临床医学研究中心）项目（SS2018008）；
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目的为了探索细胞外亲环蛋白A（cyclophilin A,CyPA）及端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其潜在机制,本课题将从动物实验和细胞实验两个方面展开研究。方法采用c57小鼠构建心肌缺血再灌注模型,使用小动物心电图验证造模成功,通过伊文思蓝-TTC染色评估心肌损伤面积,蛋白印迹法（Western blot）检测再灌注不同时间点心肌组织中CyPA、凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的蛋白表达水平,TUNEL染色进一步评估小鼠心肌组织凋亡水平。同时通过ELISA法检测分泌到小鼠外周血中的CyPA的表达水平,免疫组化检测心肌组织中CyPA的表达。经尾静脉注射CyPA抑制剂（TMN355）抑制细胞内外CyPA表达后,再次通过伊文思蓝-TTC染色、Western blot、TUNEL评估小鼠心肌组织损伤程度。利用H9c2大鼠心肌细胞构建缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）模型。通过荧光定量PCR检测心肌细胞凋亡标志基因（Bcl2、Bax）表达水平,确定H/R最佳时间点。外源性给予不同浓度重组CyPA刺激H/R状态下的H9c2细胞,通过Western blot检测Cleaved-Caspase3表达,评估细胞外CyPA对心肌细胞H/R损伤的作用。为了明确H/R损伤对心肌细胞内TERT的影响,使用Western blot分别检测TERT、H3、β-actin在细胞核内外的表达水平,并通过免疫荧光染色进一步观察TERT在H9c2大鼠心肌细胞中的表达和定位。最后,应用出核转运抑制剂莱普霉素B（Leptomycin B,LMB）抑制TERT出核转运后,通过Western blot以及流式细胞术检测细胞外CyPA介导的H/R状态下心肌细胞凋亡。结果（1）c57小鼠心肌缺血30min再灌注2h后,心肌组织细胞凋亡水平明显增加（P＜0.05）;心肌组织中CyPA蛋白表达水平在缺血再灌注状态下升高（P＜0.05）,血清中CyPA在再灌注3h时分泌量达峰值（P＜0.05）。（2）TMN355（CyPA抑制剂）可以明显改善小鼠心肌缺血再灌注状态下的心肌梗死面积（P＜0.05）、心肌细胞凋亡水平（P＜0.05）。（3）H9c2大鼠心肌细胞在缺氧6h、复氧6h的条件下,细胞凋亡基因表达水平明显上调（P＜0.05）;细胞外CyPA呈浓度依赖性诱导H/R状态下心肌细胞凋亡蛋白表达增加（200 ng/mL时达高峰）（P＜0.05）。（4）H/R状态下H9c2大鼠心肌细胞核内TERT向胞浆转位,胞浆内TERT水平升高的同时,胞核内TERT表达降低（P＜0.05）;进一步抑制TERT的出核转运后,H9c2心肌细胞在H/R状态下的凋亡水平明显改善（P＜0.05）。（5）在H/R条件下,外源性给予CyPA刺激H9c2细胞核内TERT向胞浆转运（P＜0.05）,同时心肌细胞凋亡水平明显上调（P＜0.05）;应用出核转运抑制剂（LMB）抑制TERT出核转运后,细胞外CyPA介导的H/R状态下心肌细胞凋亡水平明显下调（P＜0.05）。结论（1）CyPA通过促进细胞凋亡介导小鼠心肌缺血再灌注损伤。（2）TERT出核转运参与调控H/R状态下H9c2大鼠心肌细胞凋亡。（3）细胞外CyPA通过促进TERT出核转运的途径介导H/R状态下心肌细胞凋亡。
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