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木质纤维素是可持续利用的绿色资源,其高效利用一直是科学研究和应用技术研发领域的重要问题。锰过氧化物酶（MnPs）等丝状真菌木质素修饰酶类在木质纤维素的生物转化中发挥重要作用,而且,由芳香族污染物与木质素在结构上的相似性,MnPs也参与多种有毒物的降解和解毒过程,在生物技术和环境应用方面具有潜在的利用价值。耐热毛栓菌Trametes trogii等白腐菌是自然界主要的木质素分解微生物,是木质纤维素降解酶的重要来源,也是研究木质纤维素降解的良好材料。然而,目前白腐菌中木质素降解酶的研究,主要基于漆酶,而对白腐菌MnPs基因家族和表达等方面的认识相当有限。鉴于此,本研究以耐热毛栓菌T.trogii S0301菌株为研究材料,开展锰过氧化物酶同工酶基因结构、影响MnP基因表达的因素、酶的性质分析和表达调控等研究,主要结果如下:1、耐热毛栓菌中锰过氧化物酶同工酶基因结构及蛋白质序列分析在实验室前期已经完成耐热毛栓菌T.trogii S0301二代和三代测序和注释的基础上,我们获得该菌株中8个MnP同工酶基因序列并进行克隆。推导的蛋白序列的分析表明:该菌株中MnP由358-367个氨基酸组成,预测分子量约为38.5k Da,等电点（p I）范围为4.32～4.94,均含有信号肽,且存在保守的半胱氨酸残基;8个Tt MnP都属于I型MnP。启动子区域包含多种响应元件序列,如TATA和CAAT-box、热激元件（HSE）、异源响应元件（XRE）、光响应元件（LRE）、金属响应元件（MRE）、Cre A结合位点（CRE）、抗氧化响应元件（ARE）和胁迫响应元件,并且HSE和STRE广泛分布于所有Tt MnPs启动子区域中。2、影响耐热毛栓菌MnPs活性及基因表达的因素分析为了探明耐热毛栓菌中MnP同工酶基因家族成员基因表达规律,我们选用酶活和q PCR等方法研究了Mn2+和Cu2+等金属离子、静置和振荡培养状态、温度和双氧水等胁迫条件等因素对MnP同工酶基因表达和胞外MnP活性的影响。活性的分析表明,静置培养、Mn2+和Cu2+是影响MnP活性的关键因素。在静态液体培养中,添加Mn2+（1 m M）或Cu2+（0.2 m M或2 m M）后,MnP对2,6-DMP的最大活性约为14.0 U/m L。q PCR分析表明,Mn2+明显上调了Group I的MnP亚族（T＿trogii＿09901、09904、09903）的表达,表明这四个属于Group I族的MnP是Mn2+存在下主要MnP活性来源;而属于Group II族的T＿trogii＿11984、11971、11985和11983的四个MnP同工酶主要被Cu2+和H2O2随着温度的变化而诱导,这些条件是主要Mnp的活性来源。3、耐热毛栓菌胞外MnP纯化及酶学性质分析基于前期耐热毛栓菌T.trogii S0301中影响MnPs活性及基因表达的因素,我们对Mn2+诱导条件下该菌株胞外MnP进行了纯化和酶学性质分析。纯化获得的Tt MnP的分子量大小约为43 k Da,最适温度和p H分别为40°C和5.0。酶学性质分析表明,该Tt MnP具有较宽的p H耐受范围,在p H4～6下孵育4 h后活性依然保持在90%以上,并且在40°C和50°C具有一定的稳定性。1 m M的Mn2+、Mg2+、Ca2+对纯化的Tt MnP活性有促进作用,相对活性分别为117.93%、111.96%、113.59%。但当离子浓度增加到5 m M和10 m M时,酶活性迅速下降。Cu2+和K+对Tt MnP只有轻微的抑制作用,Fe2+和Ni+则是完全抑制了其活性。以2,6-DMP为底物对Tt MnP酶动力学参数的测定表明,Tt MnP对2,6-DMP的Km和Vmax分别为0.18 m M和9.26 m M/min,kcat为912.24 s-1,kcat/Km为5140.912 s-1 m M-1。Tt MnP对联大茴香胺盐酸盐的底物特异性最强,其次是ABTS和DMP。4、耐热毛栓菌中热激转录因子HSF与MnP活性调节实验室前期的研究发现热激转录因子HSF及其可变剪接参与耐热毛栓菌T.trogii S0301中Cu2+介导的漆酶Lac活性调节,且在选择性剪接体HSF2β-I过量表达的菌株中观测到MnP活性的增加。在此基础上,我们选用亚细胞定位、双分子荧光互补以及EMSA等技术,研究不同可变剪接体Tt HSF2α、Tt HSF2β-I和Tt HSF2β-II的相互作用及对代表性MnP基因表达的调控作用,并考察了Tt HSF2α、Tt HSF2β-I过量表达菌株对木质纤维素成分利用能力。Tt HSF2α分布于细胞核,Tt HSF2β-I在细胞质和细胞核中均有分布,而Tt HSF2β-II是主要存在细胞核中,有少量分布在细胞质中。双分子荧光互补表明只有Tt HSF2α和Tt HSF2β-I之间能发生相互作用。EMSA结果表明Tt HSF2α能与MnP同工酶（Tt09904、Tt11971、Tt09901、Tt09906）结合并出现阻滞条带,表明Tt HSF2α能与Tt MnP启动子结合。与野生型和OE-Tt HSF2α菌株相比,以木质纤维素为碳源,Cu2+为诱导剂时,HSF不同可变剪接过量表达菌株OE-Tt HSF2β-I表现为更快的菌丝延伸速度。据此,我们推测,Tt HSF2及其可变剪接可能参与耐热毛栓菌对木质纤维素的利用。综上所述,本研究完成了耐热毛栓菌T.trogii S0301中8个潜在的MnP基因结构和不同因素诱导下MnP的表达模式分析,Mn2+诱导液体培养条件下胞外MnP的纯化和性质分析,及热激转录因子HSF与MnP活性调节及木质纤维素利用关系初步分析,研究的开展拓展了我们对白腐菌MnP基因多样性和基因表达规律的认识,有助于白腐真菌MnP基因和酶资源的发掘和木质纤维素生物的资源化利用。