论文部分内容阅读
本实验通过体外模拟正畸加力低氧环境,探究低氧环境下,抑制成牙骨质细胞凋亡的可能机制,从而为减少正畸牙根吸收提供可能的治疗靶点。有研究表明,低氧环境下自噬参与调控骨细胞、成骨细胞及破骨细胞的凋亡与矿化,在骨代谢平衡中起重要作用,同时Sirt1诱导的自噬增强对氟诱导的成骨样细胞凋亡有保护作用,成牙骨质细胞与成骨细胞生物学行为相似,而低氧环境下成牙骨质细胞的自噬未见相关研究。因此,本实验拟通过建立牙根吸收模型,局部注射Sirt1激活剂白藜芦醇和/或自噬抑制剂氯喹验证“sirt1-自噬轴”在牙根吸收中的作用,并且模拟正畸加力牙周的局部低氧环境,进一步研究在低氧环境中自噬对成牙骨质细胞凋亡的影响,期待未来对成牙骨质细胞自噬的研究能够从基础转化到临床,为正畸治疗过程中牙根吸收的修复提供新的治疗方案。本研究分为体外及体内两个实验:实验一研究大鼠牙根吸收模型中“Sirt1-autophagy axis”对牙根吸收的影响。第一部分:大鼠牙根吸收模型中牙周膜组织“Sirt1-autophagy axis”相关蛋白及细胞凋亡改变。目的:建立大鼠牙根吸收模型,证明加力过程中,牙周组织“Sirt1-autophagy axis”被激活。方法:选取健康的8周龄SD雄鼠共24只,随机地分为2个组,分别为对照组和加力组,每组各12只,其中对照组未进行任何处理;在加力组大鼠的左侧上颌的第一磨牙牙冠上施加大小为100 g方向为近中的力,加力7天后处死大鼠。HE染色,抗Sirt1、LC3、p62免疫组化染色以及TUNEL染色观察牙周组织中细胞自噬和凋亡情况。结果:加力组牙根吸收陷窝较对照组增多,LC3和Sirt1在牙周膜的表达在加力组中较对照组明显增多,阳性染色加深;p62在牙周膜的表达在加力组中较对照组明显减少,阳性染色变浅。由牙周组织中LC3的平均光密度值可见,且差异均有统计学意义(P<0.05)。加力组的细胞凋亡率相较对照组增多,差异有统计学意义(P<0.05)。小结:加力情况下自噬相关蛋白量改变,自噬激活,Sirt1蛋白水平升高,凋亡增加,牙根吸收陷窝量增多。第二部分:大鼠牙根吸收模型中局部注射Sirt1、自噬调控剂后相关蛋白及牙根吸收量的改变。目的:进一步验证牙根吸收模型中“Sirt1-autophagy axis”轴的激活可以减少牙根吸收。方法:选取健康的8周龄SD雄鼠共48只,随机地分为4个组,分别为对照组、PBS组、白藜芦醇组,白藜芦醇组+氯喹组,每组各12只。于第7天处死大鼠,将标本进行Micro-CT扫描,采用三维凸包法计算牙根吸收陷窝体积。其余检测方法同实验一第一部分。结果:在加力7天时,PBS组较对照组吸收陷窝体积增大,差异无统计学意义,白藜芦醇组吸收陷窝体积较PBS组显著减小,差异有统计学意义(P<0.05),白藜芦醇+氯喹组吸收陷窝体积较白藜芦醇组显著增大,差异有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇组较PBS组LC3蛋白表达明显增加,p62蛋白表达明显减少,自噬增强;白藜芦醇+氯喹组较白藜芦醇组表现为LC3蛋白表达明显减少,p62蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。而白藜芦醇组较PBS组Sirt1蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);白藜芦醇+氯喹组较白藜芦醇组Sirt1蛋白表达减少,差异无统计学意义。白藜芦醇组较对照组的细胞凋亡率相较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇+氯喹组细胞凋亡率较对照升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结:局部应用Sirt1激活剂白藜芦醇减少了牙周组织中细胞的凋亡并且可以有效减少牙根吸收,而自噬抑制剂氯喹能阻断该作用。表明“Sirt1-autophagy axis”轴的激活可以减少牙根吸收。实验二:研究低氧环境下“Sirt1-autophagy axis”对OCCM-30细胞凋亡的影响。第一部分:低氧环境对OCCM-30细胞自噬及凋亡的影响。目的:体外模拟正畸加力造成的局部低氧环境,探究低氧对成牙骨质细胞Sirt1、自噬及凋亡的影响。方法:将细胞分为对照组、低氧组、低氧+3-MA组,分别培养12h。MDC染色观察自噬溶酶体变化;LC3 II免疫荧光检测自噬体变化;透射电镜观察自噬体;Western Blot检测Sirt1、LC3 II、p62等蛋白的表达。PI-Hoechst免疫荧光检测细胞凋亡。结果:低氧组较对照组自噬溶酶体含量明显增加;同时低氧+3-MA组较低氧组的自噬溶酶体含量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧组较对照组荧光亮点表达明显增加;低氧+3-MA组较低氧组荧光亮点表达明显减少。差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧组较对照组p62蛋白表达明显减少,LC3 II、Sirt1蛋白表达明显增加,自噬增强;低氧+3-MA组较低氧组p62蛋白表达明显增加,LC3 II、Sirt1蛋白表达明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧组较对照组凋亡细胞数量明显增加;低氧+3-MA组较低氧组凋亡细胞数量进一步增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。小结:低氧环境下,成牙骨质细胞自噬增强,Sirt1水平升高;低氧环境下,加入自噬抑制剂3-MA,成牙骨质细胞自噬减少,凋亡增加,说明低氧环境下,自噬的激活是减少成牙骨质细胞凋亡的相关机制。第二部分:低氧环境下Sirt1对OCCM-30细胞自噬的影响目的:进一步探索低氧环境下,通过抑制剂和激活剂调控Sirt1对成牙骨质细胞自噬的影响。方法:将细胞分为对照组、低氧组、低氧+白藜芦醇组、低氧+白藜芦醇+ex527组,分别培养12h,检测方法同实验二第一部分。结果:低氧组较对照组自噬溶酶体含量明显增加;同时低氧+白藜芦醇组较低氧组自噬溶酶体含量明显增加;低氧+白藜芦醇+ex527组较低氧+白藜芦醇组的自噬溶酶体含量明显减少。差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧组较对照组荧光亮点表达明显增加;低氧+白藜芦醇组较低氧组荧光亮点表达明显增加;低氧+白藜芦醇+ex527组较低氧+白藜芦醇组荧光亮点表达明显减少。差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧组较对照组LC3 II蛋白表达明显增加,p62蛋白表达明显减少,自噬增强;低氧+白藜芦醇组较低氧组LC3 II、Sirt1蛋白表达明显增加,p62蛋白表达明显减少;低氧+白藜芦醇+ex527组较低氧+白藜芦醇组LC3 II、Sirt1蛋白表达明显减少,p62蛋白表达明显增加;以上差异均有统计学意义(P<0.05)。小结:低氧环境下,加入Sirt1激活剂白藜芦醇,成牙骨质细胞Sirt1水平升高,自噬升高;说明白藜芦醇能进一步激活低氧环境下成牙骨质细胞自噬,并且使Sirt1表达增加。且低氧环境下,由白藜芦醇激活的自噬作用能被Sirt1抑制剂ex527逆转,表明了Sirt1在白藜芦醇激活的成牙骨质细胞自噬过程中有重要作用。第三部分:低氧环境下“Sirt1-autophagy axis”对OCCM-30细胞凋亡的影响目的:研究低氧环境下调控“Sirt1-autophagy axis”对OCCM-30细胞凋亡的影响。方法:将细胞分为对照组、低氧组、低氧+白藜芦醇组、低氧+白藜芦醇+3-MA组,分别培养12h,检测方法同实验二第一部分。结果:低氧+白藜芦醇组较低氧组自噬溶酶体含量明显增加;低氧+白藜芦醇+3-MA组较低氧+白藜芦醇组的自噬溶酶体含量明显减少。差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧+白藜芦醇组较低氧组荧光亮点表达明显增加;低氧+白藜芦醇+3-MA组较低氧+白藜芦醇组荧光亮点表达明显减少。差异均有统计学意义(P<0.05)。低氧+白藜芦醇组较低氧组LC3 II、Sirt1蛋白表达明显增加,p62蛋白表达明显减少;低氧+白藜芦醇+3-MA组较低氧+白藜芦醇组LC3 II蛋白表达明显减少,p62蛋白表达明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),而Sirt1蛋白表达减少,差异无统计学意义(P=0.146)。低氧+白藜芦醇组较低氧组荧光亮点表达明显减少;低氧+白藜芦醇+3-MA组较低氧+白藜芦醇组荧光亮点表达明显增加。差异均有统计学意义(P<0.05)。小结:低氧环境下,加入Sirt1激活剂白藜芦醇,成牙骨质细胞Sirt1水平升高,自噬升高,凋亡减少;且低氧环境下“Sirt1-autophagy axis”的激活减少成牙骨质细胞凋亡。而在低氧环境下,由白藜芦醇激活的自噬作用能被自噬抑制剂3-MA所抑制,而此时Sirt1表达仍然增加,提示某些自噬相关分子可能是低氧环境下Sirt1的下游作用分子。