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研究背景和目的人Cripto-1(CR-1),又称畸胎癌衍生生长因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1, TDGF-1),是表皮生长因子-Cripto-FRL-Criptic(EGF-CFC)家族成员之一,属于转化生长细胞TGF-β蛋白家族及Nodal蛋白质的共同受体,编码一种含188个氨基酸的生长因子样和/或共受体样的胞外糖蛋白,主要功能是激活胚胎发育和细胞转化中的多条信号通路。CR-1于早期胚胎上高表达,成体阶段仅肺、肾、脑、睾丸、卵巢和脾脏等上有低水平表达；在人肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌和鼻咽癌等中CR-1高表达,因此CR-1被认为是癌胚基因。通常,确定某个基因是否是瘤基因最可靠和最经典的策略和方法是,在转基因小鼠体内过表达该基因,并进而观察病理改变。目前,已建立了乳腺特异表达人CR-1基因的转基因小鼠,并观察到乳腺癌的发生；由于该模型人CR-1转基因受乳腺特异的启动子调控,故CR-1转基因仅在转基因鼠的乳腺上表达,而在其它器官不表达,因而无法利用该人CR-1转基因小鼠在体内证实CR-1基因是否也能作为瘤基因起始人类其它常见肿瘤(如肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌和鼻咽癌等)的发生。为更准确模拟潜在的瘤基因(即人CR-1基因)在人体上起始某种肿瘤发生的过程,本课题组将借助基因表达调控系统(即Cre/lox P系统)实现人CR-1转基因在转基因小鼠体内的时空表达,以建立更为理想的疾病模型,该模型将为探讨人CR-1基因在人常见肿瘤发生过程中作用提供重要工具,也将为深入研究肿瘤发病机制和确定新的分子靶向治疗靶标等奠定基础。方法1.转基因载体pRCLG构建以质粒pCI-cripto-1模板,PCR扩增目的基因人CR-1片段,并切胶回收获得Insert DNA,通过In-Fusion克隆至SmaⅠ酶切的pRLG载体中,挑选一个阳性克隆质粒进行测序,在测序的基础上进行酶切鉴定。所构建载体命名为pRCLG。2.利用细胞模型在体外验证Cre/lox P系统能否正常工作质粒pRCLG转染293FT细胞,质粒pRCLG和pCre共转染293FT细胞,48-72小时倒置荧光显微镜下观察荧光情况,然后在24孔板内分别加入底物D-luciferin,利用小动物活体成像仪检测荧光素酶(Luc)表达。48-72小时后提取pRCLG和pCre共转染的293FT细胞总RNA,采用RT-PCR方法检测Cre重组酶介导重组后下游CR-1、Luc和EGFP基因的表达情况。3. RCLG转基因片段制备pRCLG先用SfiⅠ单酶切,纯化回收的线性化片段再用SspⅠ酶切,此时pRCLG被切成两条带,回收大片段即获得转基因片段RCLG。4. RCLG转基因小鼠建立和鉴定特殊用途小鼠准备按标准程序准备受精卵供体母鼠、种公鼠、结扎公鼠和假孕母鼠等。DNA原核显微注射及胚胎输卵管移植将制备好的转基因片段RCLG注射入小鼠受精卵的原核内,注射DNA后状态良好的受精卵移植进ICR假孕母鼠输卵管内,在母体子宫内发育直至出生。RCLG转基因首建鼠筛选与鉴定获得子代鼠后,应用体视荧光显微镜和小动物活体成像仪等检测各组织mRFP表达,以筛选RCLG转基因小鼠,此即RCLG转基因首建鼠(F0代)。RCLG转基因首建鼠繁殖传代及转基因遗传和表达稳定性检测将mRFP表达阳性的首建鼠与野生型FVB鼠交配以传代,获得F1后,用体视荧光显微镜检测mRFP表达以筛选阳性个体,将mRFP表达阳性的F1代鼠与野生型FVB鼠交配以进一步传代,获得F2后,亦用体视荧光显微镜检测mRFP是否在F2代表达,对mRFP表达稳定性做出判断,并进而问接判断转基因是否稳定遗传。体视荧光显微镜检测转基因鼠各器官mRFP表达取3周龄小鼠,灌注后取各脏器,然后荧光镜检,方法如下：小鼠深度麻醉后,用PBS自小鼠左心室注入至右心房流出,直至流出液变成无色透明后,收集主要脏器(如心脏、肺、脑、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺、小肠等),然后在体视荧光显微镜下检测红色荧光。正置荧光显微镜检测转基因鼠各器官冰冻切片上mRFP表达在小鼠出生3周后,小鼠灌注(方法同上)后取出各脏器,行4%多聚甲醛后固定4-6h,流水冲洗1h后浸泡于30%蔗糖溶液中,2-3天后对各脏器行组织冰冻切片,DAPI染核后于正置荧光显微镜下检测红色荧光。5.运用Cre/lox P系统在RCLG转基因小鼠体内条件性过表达人CR-1基因RCLG转基因鼠分别与EⅡa-Cre转基因鼠和A1b-Cre转基因鼠交配而获双转基因鼠,在双转基因鼠体内,Cre介导重组将激活下游基因CR-1和Luc表达。小动物活体成像仪检测小鼠Luc表达检测前,小鼠腹腔注射D-luciferin (0.15 mg/g body wt),同时麻醉小鼠；注射底物5-10min后,利用小动物活体成像仪检测Luc表达。RT-PCR检测小鼠CR-1表达应用小动物活体成像仪证实小鼠各组织表达Luc后,提取组织RNA,采用RT-PCR检测CR-1表达以验证Cre确实介导了重组,并进而激活了下游CR-1表达。结果1.pRCLG载体构建以pCI-cripto-1模板进行PCR扩增,PCR产物大小与预期相符,回收该片段即获Insert DNA,然后通过In-Fusion将Insert DNA克隆至SmaⅠ酶切的pRLG载体中,对挑取的阳性克隆质粒测序证明插入片段序列与原始序列一致,接着用XhoⅠ和SphⅠ分别酶切该载体亦可获得预期大小的酶切片段,预示转基因载体构建成功。所构建的转基因载体命名为pRCLG。2.利用细胞模型在体外证明Cre/loxP系统能正常工作转染48-72小时后倒置荧光镜下观察可见单转pRCLG的293FT细胞发出红色荧光,pRCLG和pCre质粒共转染的293FT细胞在倒置荧光镜下可见红色或绿色荧光,说明Cre已成功介导重组,但重组不是100%发生。加入D-luciferin后,利用小动物活体成像仪可在共转染的孔中检测到Luc信号。此外,利用RT-PCR在mRNA水平亦证实转基因CR-1、Luc和EGFP能够正常表达。3. RCLG转基因片段制备先用SfiⅠ单切,回收线性化片段,再用SspⅠ酶切,回收9.436kb片段即获得转基因片段RCLG。4. RCLG转基因小鼠建立和筛选采用DNA原核显微注射法制作转基因小鼠,应用体视荧光显微镜和小动物活体成像仪在出生的后代中筛选出2只RCLG转基因首建鼠。将首建鼠与野生型FVB鼠交配以获得F1代,体视荧光显微镜和／或小动物活体成像仪检测显示,F1代鼠中部分个体表达mRFP; mRFP阳性的F1代鼠与野生型FVB鼠交配以进一步获得F2代,F2代鼠中亦有部分个体表达mRFP。以上这些数据预示外源转基因不仅可以从一代向下一代稳定传递,且能够稳定表达。体视荧光显微镜和／或小动物活体成像仪检测显示,RCLG转基因鼠主要脏器均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中心、肾、胃、肠和睾丸mRFP表达水平较高,肝、脾、肺和胸腺mRFP表达水平较低；冰冻切片结果示各脏器均可见RFP阳性的细胞。5.运用Cre/lox P系统在RCLG转基因小鼠体内条件性过表达人CR-1基因利用小动物活体成像仪在RCLG转基因鼠与A1b-Cre鼠交配所获后代中的部分个体肝脏可检测到Luc信号,预示Cre重组酶成功在肝脏介导重组,激活了下游基因Luc和CR-1表达。而在RCLG转基因鼠与EⅡa-Cre鼠交配所获后代中未检测到广泛表达Luc的个体。结论1.成功构建转基因载体pRCLG,并在体外成功验证了pRCLG的功能性；2.采用DNA原核显微注射法成功获得2只RCLG转基因首建鼠,且外源转基因能向后代稳定遗传(已传至F2代),且mRFP能够稳定表达；3. RCLG转基因鼠的主要脏器均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中心、肾、胃、肠和睾丸mRFP表达水平较高,肝、脾、肺和胸腺mRFP表达水平较低；4. RCLG转基因鼠与EⅡa-Cre鼠交配所获后代中,未检测到Luc基因被广泛激活的个体；而RCLG转基因鼠与A1b-Cre鼠交配所获后代中,部分个体Luc基因表达在肝脏被成功激活,预示运用Cre/lox P系统在转基因鼠肝脏上实现了Luc的条件性表达。