枯茗酸抑菌活性及其对西瓜枯萎病原菌的抑菌机理研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:feya520
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枯茗酸又名对异丙基苯甲酸,从孜然种子精油中分离获得,对多种植物病菌有良好的抑菌活性,具有进一步开发利用潜力,但对该化合物系统的抑菌活性和抑菌机制研究尚未清楚。本研究筛选了枯茗酸抑菌谱,测定枯茗酸对油菜菌核病菌、苹果树腐烂病菌和西瓜枯萎病菌的抑菌活性及生理生化指标的影响,选取西瓜枯萎病菌为供试菌株,利用基因敲除技术和同源建模、分子对接等手段,主要得到以下结果:(1)比较了枯茗酸与11种植物源小分子芳香酸对多种植物病菌的抑菌活性,结果表明:枯茗酸抑菌活性最强、最广谱,对3种危害严重的植物病原菌如苹果树腐烂病菌、油菜菌核病菌和西瓜枯萎病菌具有显著的皿内抑菌活性,EC50值分别为4.17、18.76和22.87μg/ml。测定不同pH培养基对枯茗酸抑菌活性的影响,发现其抑菌活性是本身的活性,而不是受pH的影响。(2)离体组织法和盆栽法测定枯茗酸对3种植物病原菌油菜菌核病菌、苹果树腐烂病菌和西瓜枯萎病菌的室内药效,结果显示枯茗酸对以上三种病菌良好的室内药效,且保护活性大于治疗活性,枯茗酸1000μg/ml的防效均大于50%。枯茗酸处理后,以上三种病菌均有相似的生理生化变化,包括菌丝簇生缠绕加剧、表面萎缩并塌陷;菌丝细胞膜通透性和甘油含量显著增加;主要致病因子如草酸、果胶酶和镰刀菌酸毒素含量显著降低。此外,枯茗酸处理寄主防御酶系如SOD,POD,CAT和PAL等活性均显著增强,这表明枯茗酸不仅具有较高的抑菌活性,还可以提高寄主植物的系统防御力。(3)采用基因敲除、PCR及Southern杂交等手段,对西瓜枯萎病菌次生代谢调控基因(vel1、lae1)和比卡菌红素合成基因(bik2、bik3)进行敲除与回补,并对所得转化子进行验证,成功获得vel1、lae1、bik2和bik3基因的敲除突变菌株(Δfovel1、Δfolae1、Δfobik2和Δfobik3)的回补突变菌株(Δfovel1-C,Δfolae1-C,Δfobik2-C和Δfobik3-C)。(4)比较野生型菌株、敲除菌株和回补菌株生理表型的差异,结果显示:Δfovel1和Δfolae1菌丝颜色消失、细胞膜完整性破坏、菌丝生长速率和分生孢子量降低,比卡菌红素和镰刀菌酸毒素合成降低、致病力丧失;Δfobik2和Δfobik3在黑暗条件下色素完全消失,对氧化压敏感性增加,POD活性降低;敲除突变体中的所有变化在其对应的回补菌株中均得到恢复。以上结果表明,Bik2和Bik3基因能够调控比卡菌红素合成和病菌对寄主系统防御的耐受力。Vel1和Lae1基因在西瓜枯萎病菌中调控细胞膜结构、菌丝生长、分生孢子产生、比卡菌红素和镰刀菌酸毒素的合成和致病力。(5)测定枯茗酸处理后各菌株生理生化的变化,结果显示:Δfovel1、Δfolae1、Δfobik2和Δfobik3突变体对枯茗酸的EC50值增加为野生菌的3.41、2.23、1.16和1.57倍;且枯茗酸对Δfovel1和Δfolae1生理效应的影响均弱于野生菌,因此推测velvet家族蛋白是枯茗酸靶标之一。(6)应用SWISS-MODEL workplace对fovel1、folae1、fobik2和fobik3蛋白进行同源模建,并以模建结果为受体及枯茗酸的3D结构为配体,应用Autodock进行分子对接,最后应用PyMOL软件对所得对接结果进行分析。结果表明:枯茗酸与潜在靶标蛋白folae1、fovel1、fobik2和fobik3均具备理论上的结合可能性;分子模拟对接结果及参数分析表明枯茗酸与受体蛋白folae1以及fovel1发生结合的机率最大,配体分子与受体蛋白形成氢键结合。folae1侧链氨基酸残基Glu273、Arg206和Asn208形成5条氢键结合,键长为2.1、2.4、2.3、1.9、2.2?,结合能为-4.64 kcal/mol;与受体蛋白fovel1链氨基酸残基Arg163,Arg104形成4条氢键结合,键长为1.7、2.2、2.3、1.9?,结合能为-5.34 kcal/mol。综上所述,枯茗酸对西瓜枯萎病菌抑菌机制可能为:枯茗酸以folae1和fovel1为结合靶标,通过作用于velvet家族蛋白,影响病菌细胞膜结构、孢子萌发和菌丝生长,并抑制镰刀菌酸毒素和比卡菌红素的产生,进而降低西瓜枯萎病菌的致病力及对寄主植物防御反应的适应性,达到防治西瓜枯萎病的效果。且枯茗酸对多种植物病菌均具有显著的抑菌活性,具有开发成植物源杀菌剂的潜力。
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