Wnt基因编码的是一类分泌性的糖蛋白配体,通常长度在350-400个氨基酸,具有一个或多个N末端的糖基化位点,在不同物种中具有高度保守的序列区域。它们在多细胞动物的胚胎发育过程中和成体组织细胞中都扮演着重要的作用,包括胚胎体轴形成,器官发生,细胞的命运决定、增殖、迁移和再生,以及成体细胞内稳态维维持等众多方面。在贝类中对Wnt基因及蛋白的研究有助于我们更好地了解其在无脊椎动物中的作用,特别是相关基因在贝类胚胎发育过程和成体组织中扮演的重要角色,从而更好地丰富我们对冠轮动物胚胎发育和个体发生的理解和认识。同时,Wnt作为一个在各个物种中被广泛重视和研究的信号传导分子基因家族,其各个亚家族内的基因在不同物种中不仅序列上相对保守,而且在功能上也存在这一定关联性。从不同物种基因组层面上对Wnt基因各亚家族及其成员的分布情况进行全面细致的发掘,鉴定和比较,有助于我们更好地揭示生命起源和物种进化过程中的秘密。本论文从后生动物的基因组水平系统的研究Wnt基因,并重点关注了冠轮动物超门这个研究尚且较少的分支,选取了4个环节动物,14个软体动物,8个扁形动物,1个轮虫动物和1腕足动物,并结合其它7个模式动物种类(海绵动物,刺胞动物,蜕皮动物和后口动物),对该基因的亚家族成员进行了全面的鉴定和划分,从基因组水平上全面的分析了所有含有Wnt保守结构域的序列,系统地统计了基因组中存在的Wnt基因间连锁cluster数量,并用目前常用的构建分子进化发育树的手段对所有序列进行了亚家族分类划分,研究了各物种Wnt基因各亚家族成员的分布特点,并从序列结构上对其做了初步分析;利用已有的RNA-seq数据和芯片数据分析了6个物种不同发育时期中Wnt基因的时序表达,并做了相关性分析;利用长牡蛎Wnt基因在不同组织的转录表达,验证其功能多样性,并采用免疫荧光和整体原位杂交方法进行Wnt6蛋白水平的功能初步验证了。一、典型后生动物的Wnt基因亚家族的分布、结构特点从35个后生动物基因组中共获取了478条含有Wnt结构域的序列,并将结果与之前的研究进行对比发现:海葵中新增了4个,斑马鱼和海胆中各减少了1个,果蝇,线虫和水蚤中数量不变,笠贝和曼氏血吸虫新增了1个,水蛭中新增4个;并在冠轮动物海豆芽,海兔,双脐螺,椎实螺,萝卜螺,偏顶蛤,深海贻贝,紫贻贝,虾夷扇贝,美洲牡蛎,长牡蛎,章鱼,珍珠贝,轮虫,旋鳃虫,日本血吸虫,裂体血吸虫和链状带绦虫中首次系统报道了Wnt基因亚家族分类情况。各个物种基因组中含有3个到39个Wnt基因位点,通过进一步的分子进化发育树分析,我们验证并发展了以前的一些研究结果,如验证了Wnt3只存在于刺胞动物和后口动物,预示Wnt3在蜕皮动物和冠轮动物最后共同祖先的进化中发生丢失;Wnt9只存在于两侧对称动物可能预示着类似的进化丢失;海绵基因组三个Wnt基因中原先无法划分亚家族的,被我们划分到了各自的亚家族;Wnt8被进一步发现可能在软体动物腹足纲中缺失,而不是之前报道了在整个软体动物中发生了特异性丢失。另外,扁形动物的Wnt基因比较特殊,显示了较大的序列多态性差异,除了Wnt1,Wnt2,Wnt5,Wnt11外,还单独聚成了一分支,本研究中临时将其命名为Unclassified,在除开扁形动物的序列后,我们将剩下的311条Wnt序列通过构建分子进化发育树,划分到13个Wnt亚家族中,发现了三组亲缘性较高的亚家族,预示其可能是物种进化过程中基因复制分化造成的结果:Wnt1-Wnt6(BS=76%,BI=100%),Wnt4-Wnt11(BS=51%,BI=96%)和Wnt9-Wnt10(BS=46%,BI=71%)。基因连锁分析表明,Wnt基因在基因组上连锁分布的情况广泛存在于整个后生动物中,除了之前报道过的Wnt10-Wnt6-Wnt1-Wnt9和Wnt7-Wnt5的cluster外,还有许多其它的一些cluster被发现,如NveWnt8aa-Nve Wnt8ab,ShaWnt2b-ShaWnt2a等,这可能揭示了Wnt基因存在串联重复产生新基因的可能,它们在功能上可能具有潜在的相似性和互补性。二、不同物种中Wnt基因的表达时空表达分析基于长牡蛎、果蝇、线虫、斑马鱼、海豆芽和海葵这6个物种不同发育时期的RNA-seq和芯片数据的分析,我们发现Wnt亚家族分别在不同发育阶段明显上调表达,如母源性表达的Wnt5和Wnt9,胚胎发育期表达的Wnt1,Wnt2,Wnt3,Wnt4和Wnt8,还有前中期和后期都有上调表达的有Wnt6,Wnt11和WntA。这些多样化表达模式提示我们Wnt亚家族成员的功能具有多样化的特点;进一步对这些表达模式进行相关性分析表明,Wnt10-Wnt6-Wnt1-Wnt9基因Cluster的部分基因的表达水平的相关性也在海豆芽和长牡蛎中为显著相关,如海豆芽中的LanWnt10aa、LanWnt10ab和LanWnt6,以及长牡蛎中的CgiWnt10、Cgi Wnt6、CgiWnt1和CgiWnt9a;Wnt基因在长牡蛎不同组织中的表达具有多样性的特点,显示不同Wnt基因在各个组织中的差异化功能,同时结合不同发育时期、不同组织中的表达,我们可以推测Wnt10-Wnt6-Wnt1-Wnt9这个保守的cluster中的部分基因极有可能参与了胚胎发育过程中肠系统的发生过程。三、长牡蛎幼虫原位杂交和免疫荧光分析长牡蛎不同发育时期胚胎和幼虫的免疫荧光实验和整体原位杂交实验表明长牡蛎的胃和肠发育中,CgiWnt6蛋白水平显示出了较高的表达,可能参与了肠的发育形成过程;比较不同物种的Wnt6亚家族基因的外显子和内含子数量时,我们发现其具有高度的结构保守性,在两侧对称动物中都保留了4外显子的结构;同时RNA表达水平相关性的结果提示我们与长牡蛎CgiWnt6在基因组上形成cluster的CgiWnt1、CgiWnt9a和CgiWnt10基因也可能参与该过程的发生;该基因簇在长牡蛎肠系统中高度表达,结合目前Wnt基因在不同动物,尤其是模式动物中的研究结果,我们推测它们可能参与了长牡蛎的肠系统的发育过程。