目的:羧甲基壳聚糖/无定形磷酸钙(CMC/ACP)是一种具有仿生再矿化功能的新型生物制剂,但其对口腔致龋菌斑形成的作用尚不明确。本研究在实验室条件下建立人类牙釉质表面口腔致龋细菌生物膜的体外模型,进一步探讨该纳米复合物对变形链球菌、戈登链球菌和具核梭杆菌的生长、粘附、共聚和生物膜形成的影响,并初步分析其作用机制。为探寻具有促进再矿化和抑制致龋菌斑形成双重功能的口腔抗龋制剂提供实验依据和参考。方法:1.牙釉质片与羟基磷灰石片的制备依据纳入标准收集新鲜拔除的第三磨牙(已获得天津医科大学伦理委员会(TMUSHhMEC2017090)的批准),在其颊舌面切割并用400至2000目的SiC砂纸打磨抛光制备成牙釉质片(大小约4×3×2mm);用于激光共聚焦扫描显微镜分析基质的羟基磷灰石片(直径5.0mm,厚度2.0mm)预先使用2000目的SiC砂纸抛光。所有的牙釉质片和羟基磷灰石片均高温高压灭菌30 min后浸泡于无菌生理盐水中4℃保存备用。2.唾液获得性膜的制备从10名健康成年志愿者中收集非刺激性唾液样品,混合并立即在4℃下12,000×g离心20分钟。无菌过滤后,在37℃下将釉质片或羟基磷灰石片浸泡在上述处理后的唾液中30分钟以形成唾液获得性膜。3.CMC/ACP纳米复合物的制备及表征使用聚电解质介导合成法制备1%CMC/ACP矿物溶液,应用透射电子显微镜(TEM)和110kV的选择区域电子衍射(SAED)表征CMC/ACP纳米复合物,分析颗粒的尺寸和形态。4.CMC/ACP抑菌性能分析1%CMC/ACP、CMC或去离子水与变形链球菌、戈登链球菌和具核梭杆菌分别混合培养,在37℃厌氧环境下培养24小时后,采用平板菌落计数法检测活菌数量(CFU)。5.CMC/ACP对细菌粘附的影响1%CMC/ACP、CMC或去离子水与等体积的变形链球菌或戈登链球菌悬浮液混合加入到放置了釉质片的48孔板中,在厌氧条件下37℃孵育1或5小时。使用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌粘附情况,并随机选择9个3000倍放大视野,计数1mm ~2釉质片上粘附的细菌数量。6.CMC/ACP对细菌生物膜形成的影响1%CMC/ACP、CMC或去离子水与等体积的变形链球菌或戈登链球菌悬浮液混合加入到置有釉质片的48孔板中,在厌氧条件下37℃培养24小时。结晶紫染色法检测生物膜总生物量。7.CMC/ACP对细菌共聚的影响首先在羟基磷灰石片表面培养形成碘化己啶(HI)标记的变形链球菌或戈登链球菌24h生物膜。再加入羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的具核梭杆菌悬浮液和等体积的1%CMC/ACP、CMC或去离子水,在37℃下厌氧避光培养24小时。培养结束后应用激光共聚焦扫描显微镜观察具核梭杆菌粘附于链球菌生物膜上的情况。对于每个样品,随机选择5个放大400的区域获得荧光图像,并用图像分析软件(Imaris v.7.2.3)分析,以确定各组绿色与红色荧光的比率(GR比)。8.机制研究-细胞表面电荷分析将变形链球菌或戈登链球菌与1%CMC/ACP、1%CMC或去离子水等体积混合,置于37℃恒温箱中孵育1小时。应用细胞色素C结合法计算与各组细胞色素C的变化量。应用Zeta电位测量法检测1%CMC/ACP、1%CMC、变形链球菌悬液、变形链球菌液与等体积1%CMC/ACP或1%CMC混合液的电位值。综合分析细胞表面电荷的变化。9.数据分析使用SPSS v.22.0软件(IBM,Armonk,NY,USA)进行统计学分析。采用单因素方差分析,Tukey-Kramer多重比较事后检验和双尾非配对t检验来评估组间差异。显著性水平为α=0.05。结果:1.CMC/ACP纳米颗粒为非晶结构TEM图像显示CMC/ACP纳米颗粒表面粗糙且其直径<100nm,SAED分析单颗粒未显示明显的晶体结构的点或环形图案特征,表明CMC/ACP纳米颗粒主要结构为非晶相。2.CMC/ACP无抑菌活性各组细菌在培养24小时后,琼脂平板上的活菌落数没有显著差异。表明1%浓度的CMC/ACP对变形链球菌、戈登链球菌和具核梭杆菌的生长没有显著影响。3.CMC/ACP抑制细菌在釉质表面初期粘附与去离子水组相比,1%CMC/ACP纳米复合物对变形链球菌和戈登链球菌在釉质表面1小时的粘附抑制率分别为89.7%和86.1%(P<0.01),对其5小时粘附抑制率分别为80.8%和82.1%(P<0.01)。CMC/ACP和CMC组之间没有显着差异。4.CMC/ACP抑制细菌在釉质表面生物膜形成与去离子水组相比,1%CMC/ACP纳米复合物对变形链球菌和戈登链球菌在釉质表面24h生物膜形成的抑制率分别为45.3%和44.0%(P<0.01)。CMC/ACP和CMC组之间没有显着差异。5.CMC/ACP抑制细菌共聚与去离子水组相比,1%CMC/ACP纳米复合物可显著降低具核梭杆菌与变形链球菌、戈登链球菌的共聚,其抑制率分别达74.6%和74.9%。CMC/ACP和CMC组之间没有显着差异。6.CMC/ACP显著改变细菌表面电荷与去离子水组相比,1%CMC/ACP使变形链球菌和戈登链球菌表面结合的细胞色素C的量分别减少12.6%和11.9%(P<0.01)。CMC/ACP和CMC组之间没有显着差异。CMC、CMC/ACP和未处理的变形链球菌的平均zeta电位分别为-41.6、-28.1和-38.2mV,1%CMC和1%CMC/ACP使变形链球菌的zeta电位显著降低至-31.3和-22.1mV(P<0.05)。结论:1、CMC能有效稳定ACP形成稳定非晶结构的CMC/ACP纳米复合物。2、CMC/ACP对变形链球菌、戈登链球菌和具核梭杆菌的生长无影响。3、CMC/ACP显著抑制变形链球菌和戈登链球菌在釉质表面的早期粘附。4、CMC/ACP显著抑制变形链球菌和戈登链球菌在釉质表面的24h生物膜形成。5、CMC/ACP显著抑制具核梭杆菌与变形链球菌或戈登链球菌的共聚。6、CMC/ACP显著改变变形链球菌表面电荷。