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研究目的:心肌缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤是缺血心肌在恢复血供后,仍然会发生心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面的进一步损害,常发生在急性心肌梗死等缺血性心脏病。I/R损伤会导致梗死面积扩大、严重心律失常、心功能进一步被抑制等严重后果,因此I/R损伤的防治一直是心血管研究中一个急需解决的难题。7,8-二羟基黄酮(7,8-dihydroxyflavone,7,8-DHF)是一种黄酮化合物,可作为酪氨酸激酶B(Trk B)受体激动剂发挥强大的神经保护和营养作用。在心血管研究中,7,8-DHF能舒张大鼠的胸主动脉,该作用和激活NO/c GMP信号途径和阻断胞内钙释放和胞外钙内流有关。7,8-DHF还能够抑制H2O2诱导的内皮细胞损伤,但是7,8-DHF对缺血心肌的保护作用无相关报道。本研究通过建立大鼠心脏-缺血再灌注损伤模型,观察7,8-DHF对再灌注心肌的保护作用并对其作用机制进行研究。研究内容和方法:Wistar大鼠随机分为三组:假手术组(sham)、模型对照组(I/R)、药物治疗组(I/R+7,8-DHF),每组5-6只。Sham组动物开胸只穿线不结扎,I/R组先缺血30 min再恢复供血供3 h,药物治疗组先缺血30 min,恢复血供前10 min腹腔注射7,8-DHF(10 mg/kg)。取I/R组大鼠2只,再灌注3 h后重新结扎左冠状动脉前降支(LAD),将Evans blue注入左心室,大鼠双上肢和耳朵变蓝后取出心脏,从心尖向心底切片,再进行TTC染色,鉴定大鼠的缺血-再灌注模型是否成功。其他动物处死后分别从心脏取血、取结扎线以下心肌组织进行各种检测。1.血清心肌酶学检测:使用速率法检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,使用免疫抑制法检测血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。2.氧化应激指标检测:WST-8法检测心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA比色法检测丙二醛(MDA)含量,Western blot法检测phospho-Histone H2A.X(p-H2A.X)蛋白水平。3.凋亡指标检测:Western blot法检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表达变化。4.信号通路检测:Western blot法检测Erk和Akt通路蛋白的变化。5.形态学检测:利用HE染色法观察心肌组织形态学改变。实验结果:1.Evans blue-TTC染色结果发现心脏被染成三个部分:蓝色部分为正常心肌,红色部分为缺血危险区,白色部分为心肌梗死区,提示心肌缺血-再灌注损伤造模成功。2.血清心肌酶学结果显示:与sham组相比,I/R组血清LDH及CK-MB活性显著增加(LDH:2415.17±80.96 U/L v.s 1596.00±145.46 U/L,P<0.01;CK-MB:1019.40±63.48U/L v.s 557.50±111.40 U/L,P<0.01),7,8-DHF明显降低LDH和CK-MB水平(LDH:1868.50±90.15 U/L v.s 2415.17±80.96 U/L,P<0.01;CK-MB:647.50±84.59 U/L v.s1019.40±63.48 U/L,P<0.05),提示7,8-DHF对大鼠缺血-再灌注损伤具有一定的保护作用。3.氧化应激指标结果显示:与sham组相比,I/R组心肌组织MDA含量升高1.78倍(1.21±0.22μmo L/mg v.s 0.68±0.20μmo L/mg,P<0.01),SOD活性则明显降低(13.07±2.40 U/mg v.s 22.22±0.57 U/mg,P<0.01),p-H2A.X水平升高了2.64倍(1.11±0.13 v.s 0.42±0.20,P<0.01)。以上结果提示缺血-再灌注心肌存在严重的氧化应激损伤。7,8-DHF明显降低了MDA含量(0.88±0.15μmo L/mg v.s 1.21±0.22μmo L/mg,P<0.05),增加了SOD活性(18.51±0.46 U/mg v.s 13.07±2.40 U/mg,P<0.05)并且抑制了p-H2A.X蛋白表达(0.71±0.12 v.s 1.11±0.13,P<0.05),提示7,8-DHF的保护作用和其抗氧化作用有关。4.凋亡检测结果如下:与sham组相比,I/R组心肌Bcl-2表达水平显著降低(0.65±0.12v.s 1.40±0.13,P<0.01),Bax表达增加(1.85±0.52 v.s 0.59±0.35,P<0.01),而凋亡酶caspase-3的激活增加(1.14±0.19 v.s 0.58±0.19,P<0.01),说明缺血-再灌注诱导了明显的心肌细胞凋亡。7,8-DHF处理后,Bcl-2表达水平显著升高(1.17±0.03v.s 0.65±0.12,P<0.05),Bax表达减少(1.00±0.18 v.s 1.85±0.52,P<0.01),cleaved caspase-3表达减少(0.76±0.18 v.s 1.14±0.19,P<0.05)。因此7,8-DHF可能通过抑制心肌细胞凋亡对缺血-再灌注心肌发挥保护作用。5.通过检测Erk蛋白发现:与sham组相比,I/R组心肌组织Erk蛋白表达明显减少(0.49±0.22 v.s 1.12±0.22,P<0.05)。与I/R组相比较,I/R+7,8-DHF组Erk表达显著增强(0.97±0.18 v.s 0.49±0.22,P<0.05),我们推测7,8-DHF的保护作用可能有Erk信号通路的参与。6.通过检测Akt蛋白发现:与sham组相比,I/R组心肌Akt蛋白表达增加(1.90±0.46v.s 0.89±0.28,P<0.01),与I/R组相比较,I/R+7,8-DHF组Akt明显降低(1.20±0.21v.s 1.90±0.46,P<0.05),Akt是否参与7,8-DHF的保护作用需要进一步研究。7.HE染色切片显示:I/R组心肌损伤严重,部分心肌细胞核丢失、心肌纤维排列紊乱,而给与7,8-DHF后心肌损伤有所减轻。结论:综上所述,7,8-DHF处理对大鼠的缺血-再灌注损伤具有保护作用,该作用可能和7,8-DHF抑制心肌的氧化应激损伤、减少心肌细胞凋亡有关。