EPSPS基因Bar基因的克隆及在蓖麻中的功能验证

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蓖麻(Ricinus communisL.)是世界十大油料作物之一。目前,尚未有转基因抗除草剂蓖麻品种。本试验以蓖麻优良父本“2129”为试验材料,通过PCR扩增法,克隆EPSPS基因和Bar基因,构建植物表达载体pCAMBIA3301-Bar-EPSPS,利用农杆菌介导法将EPSPS基因和Bar基因同时转到蓖麻体内。为培育具有抗除草剂的蓖麻新品种奠定基础。本试验的研究结果如下:  1、根据GenBank中公布的EPSPS基因序列以及重叠延伸PCR的原理,设计了19对引物,引物长度为60pb,并且相邻两个引物之间有20pb的碱基重叠,在第19对引物的两端加入酶切位点XhoⅠ。根据Bar基因序列及重叠延伸PCR的原理,设计11对引物,引物长度为60bp,并且相邻引物之间有20bp碱基重叠,在第11对引物的两端分别添加酶切位点NcoⅠ、BstEⅡ。采用PCR扩增法,获得EPSPS基因和Bar基因的全长序列,分别经回收、连接、转化、鉴定、测序、分析比对后,得到EPSPS、Bar基因1529bp、831 bp全长序列。  2、将表达载体质粒pCAMBIA3301线性化,用NcoⅠ、BstEⅡ将Bar基因从克隆载体上切下,然后将二者连接,经转化、鉴定,获得pCAMBIA3301-Bar质粒。用XhoⅠ将pCAMBIA3301-Bar线性化,将EPSPS基因从克隆载体上切下,将二者连接,经转化、鉴定,获得pCAMBIA3301-Bar-EPSPS表达载体,并确定EPSPS基因连接方向正确。  3、将构建好的植物表达载体pCAM BIA3301-Bar-EPSPS通过冻融法转化到农杆菌感受态EHA105中。  4、对蓖麻子叶节的抗草铵膦浓度进行筛选,最终确定在抗性筛选培养基中,加入0.1 mg/L的草铵膦时为最适浓度。  5、采用农杆菌介导法,将pCAM BIA3301-Bar-EPSPS对蓖麻子叶节进行遗传转化,经抗性筛选最终获得抗性植株72株。经PCR扩增检测,1株为转基因植株。
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