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G4 DNA(G-quadruplex)是一类由富含连续鸟嘌呤的DNA序列形成的四链螺旋结构，其通过同一平面上的四个鸟嘌呤之间形成氢键配对来维持结构稳定。生物信息学分析表明G4 DNA序列大量分布在各个生物体的基因组中，特别是与基因与基因组代谢密切的区域，例如端粒末端、DNA复制起始区、基因转录调控区和癌基因启动子等区域。最近通过高分辨测序技术已经确定人类基因组中至少存在716，310个G4序列，同时使用能够与G4特异结合的抗体与药物小分子识别也进一步证实了G4高级结构在活体细胞中的真实存在。因此，G4结构将会对DNA复制、DNA修复、基因转录与翻译、端粒代谢等多种生命代谢产生重要的影响。目前有部分研究表明，负责高等生物基因组复制的DNA聚合酶将会被G4结构阻碍，从而发生复制叉停滞现象。与此同时，在高等生物中还发现了一些能够特异识别并复制G4结构的损伤修复合成(TLS)DNA聚合酶，包括人类聚合酶Rev1、聚合酶η和聚合酶κ。
尽管高等生物中G4复制的研究已有部分进展，但是在原核生物中G4及其中间体的数量、原核聚合酶在复制过程中遭遇G4之后的反应现象以及原核生物体中G4的复制机制等问题，都还没有任何的研究与报道。目前大肠杆菌包含5种DNA聚合酶(Pol)，分别是PolⅠ、PolⅡ、PolⅢ、PolⅣ和PolⅥ，其中DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)在大肠杆菌中最为丰富（每个细胞约含有400个PolⅠ）。与此同时，PolⅠ广泛参与后滞链上冈崎片段的成熟、DNA的修复、DNA的同源重组以及一些损伤修复合成过程，而在这些DNA代谢过程中，含有G4序列的DNA单链极易形成某种G4结构，因此PolⅠ必定会遭遇G4结构。因此，本课题结合单分子FRET技术(smFRET)、stop-flow技术和DNA聚合酶阻滞技术等实验手段，系统地探究了大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在不同的条件下对G4结构的复制过程及其复制机理。并取得了以下结论:
(1)通过生物信息学分析可以确定，大肠杆菌基因组中的确存在G4及其中间体序列，并且有两类G4模体非常保守。此外本研究还使用已有的高通量测序数据分析了G4对高通量测序读取覆盖度(reads coverage)的影响，结果表明G4序列将会显著影响测序读取覆盖度，因此其可能对DNA复制产生重要的影响。(2)通过smFRET技术研究了低浓度的聚合酶对G4的复制过程。结果发现，DNA聚合酶Ⅰ对G4的复制受到G4结构稳定性的影响。当G4结构稳定性较低的时候，DNA聚合酶Ⅰ能够完全或者部分复制G4结构，当G4结构稳定性较高的时候，DNA聚合酶Ⅰ将完全被G4结构阻碍。(3)通过DNA聚合酶阻滞实验发现生理浓度下的DNA聚合酶Ⅰ能够顺利完成常规的稳定的G4结构的复制，但是对于某些极其稳定的G4结构，例如CEB-G4和4G4，高浓度的DNA聚合酶Ⅰ仍然完全被阻碍。(4)使用stop-flow实验确定了DNA聚合酶Ⅰ对G4结构的复制机制:DNA聚合酶Ⅰ必须依赖于dNTPs的水解释放的能量来破坏G4结构，并且可能需要DNA聚合酶Ⅰ的多聚化实现G4结构的完全复制。而这和高等生物聚合酶Rev1对G4的复制机制完全不同。
与此同时，大肠杆菌中还存在一种能够特异地识别并解旋G4结构的DNA解旋酶RecQ。作为RecQ家族解旋酶的结构与功能原型，RecQ在大肠杆菌的DNA损伤修复与基因同源重组等细胞代谢过程中发挥着至关重要的作用。因此，本研究使用smFRET技术系统地探测了RecQ解旋酶对双链DNA以及G4 DNA的结合与解旋过程，与此同时确定了HRDC结构域对RecQ催化核心的活性影响。并取得了以下结论:
(1) RecQ对DNA的结合能力非常强，但是HRDC结构域对DNA的结合能力有显著的促进作用。进一步研究发现这种促进过程可能依赖于HRDC结构域对RecA的构象的改变，从而增强了RecQ催化核心对DNA的结合能力。(2) RecQ在双链DNA的解旋之前将会出现显著的等待过程，这个过程受到HRDC结构域的调节。当HRDC结构域存在的时候，解旋等待时间将会极大增长，说明HRDC结构域在一定程度上抑制了解旋起始。同时RecQ解旋DNA的过程中将会出现链转换现象，这种链转换过程同样受到HRDC结构域的抑制。(3) RecQ具有单链DNA拉拽活性(reeling process)。当HRDC结构域不存在时，reeling过程非常频繁，HRDC结构域存在时，reeling过程非常稀少，因此HRDC结构域对DNA reeling过程同样有抑制作用。(4) RecQ能够解旋G4结构，并且必须依赖于ATP的水解，但是G4结构对于RecQ而言仍然是一种障碍。当HRDC结构域存在的时候，RecQ催化核心对G4结构的破坏程度更彻底以及其对G4的单次解旋的时间更长，因此HRDC结构域能够显著增强RecQ解旋G4的能力。
综上所述，本研究结合了smFRET技术、DNA聚合酶阻滞分析和stop-flow技术等研究方法对大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ复制G4的过程进行了系统的研究，并确定了G4的复制机制。与此同时，这些方法也可以广泛地运用于其他的聚合酶对G4或其他DNA结构的复制研究，以便于发现DNA复制的分子机制。同时，本研究使用smFRET技术实时探测了大肠杆菌RecQ解旋酶对DNA的结合、双链DNA的解旋、G4 DNA的解旋等一系列DNA代谢过程，明确了RecQ对双链DNA与G4 DNA的解旋机制。与此同时，本研究证实了HRDC结构域在RecQ对DNA代谢过程中的影响及其作用机制。
尽管高等生物中G4复制的研究已有部分进展，但是在原核生物中G4及其中间体的数量、原核聚合酶在复制过程中遭遇G4之后的反应现象以及原核生物体中G4的复制机制等问题，都还没有任何的研究与报道。目前大肠杆菌包含5种DNA聚合酶(Pol)，分别是PolⅠ、PolⅡ、PolⅢ、PolⅣ和PolⅥ，其中DNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)在大肠杆菌中最为丰富（每个细胞约含有400个PolⅠ）。与此同时，PolⅠ广泛参与后滞链上冈崎片段的成熟、DNA的修复、DNA的同源重组以及一些损伤修复合成过程，而在这些DNA代谢过程中，含有G4序列的DNA单链极易形成某种G4结构，因此PolⅠ必定会遭遇G4结构。因此，本课题结合单分子FRET技术(smFRET)、stop-flow技术和DNA聚合酶阻滞技术等实验手段，系统地探究了大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在不同的条件下对G4结构的复制过程及其复制机理。并取得了以下结论:
(1)通过生物信息学分析可以确定，大肠杆菌基因组中的确存在G4及其中间体序列，并且有两类G4模体非常保守。此外本研究还使用已有的高通量测序数据分析了G4对高通量测序读取覆盖度(reads coverage)的影响，结果表明G4序列将会显著影响测序读取覆盖度，因此其可能对DNA复制产生重要的影响。(2)通过smFRET技术研究了低浓度的聚合酶对G4的复制过程。结果发现，DNA聚合酶Ⅰ对G4的复制受到G4结构稳定性的影响。当G4结构稳定性较低的时候，DNA聚合酶Ⅰ能够完全或者部分复制G4结构，当G4结构稳定性较高的时候，DNA聚合酶Ⅰ将完全被G4结构阻碍。(3)通过DNA聚合酶阻滞实验发现生理浓度下的DNA聚合酶Ⅰ能够顺利完成常规的稳定的G4结构的复制，但是对于某些极其稳定的G4结构，例如CEB-G4和4G4，高浓度的DNA聚合酶Ⅰ仍然完全被阻碍。(4)使用stop-flow实验确定了DNA聚合酶Ⅰ对G4结构的复制机制:DNA聚合酶Ⅰ必须依赖于dNTPs的水解释放的能量来破坏G4结构，并且可能需要DNA聚合酶Ⅰ的多聚化实现G4结构的完全复制。而这和高等生物聚合酶Rev1对G4的复制机制完全不同。
与此同时，大肠杆菌中还存在一种能够特异地识别并解旋G4结构的DNA解旋酶RecQ。作为RecQ家族解旋酶的结构与功能原型，RecQ在大肠杆菌的DNA损伤修复与基因同源重组等细胞代谢过程中发挥着至关重要的作用。因此，本研究使用smFRET技术系统地探测了RecQ解旋酶对双链DNA以及G4 DNA的结合与解旋过程，与此同时确定了HRDC结构域对RecQ催化核心的活性影响。并取得了以下结论:
(1) RecQ对DNA的结合能力非常强，但是HRDC结构域对DNA的结合能力有显著的促进作用。进一步研究发现这种促进过程可能依赖于HRDC结构域对RecA的构象的改变，从而增强了RecQ催化核心对DNA的结合能力。(2) RecQ在双链DNA的解旋之前将会出现显著的等待过程，这个过程受到HRDC结构域的调节。当HRDC结构域存在的时候，解旋等待时间将会极大增长，说明HRDC结构域在一定程度上抑制了解旋起始。同时RecQ解旋DNA的过程中将会出现链转换现象，这种链转换过程同样受到HRDC结构域的抑制。(3) RecQ具有单链DNA拉拽活性(reeling process)。当HRDC结构域不存在时，reeling过程非常频繁，HRDC结构域存在时，reeling过程非常稀少，因此HRDC结构域对DNA reeling过程同样有抑制作用。(4) RecQ能够解旋G4结构，并且必须依赖于ATP的水解，但是G4结构对于RecQ而言仍然是一种障碍。当HRDC结构域存在的时候，RecQ催化核心对G4结构的破坏程度更彻底以及其对G4的单次解旋的时间更长，因此HRDC结构域能够显著增强RecQ解旋G4的能力。
综上所述，本研究结合了smFRET技术、DNA聚合酶阻滞分析和stop-flow技术等研究方法对大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ复制G4的过程进行了系统的研究，并确定了G4的复制机制。与此同时，这些方法也可以广泛地运用于其他的聚合酶对G4或其他DNA结构的复制研究，以便于发现DNA复制的分子机制。同时，本研究使用smFRET技术实时探测了大肠杆菌RecQ解旋酶对DNA的结合、双链DNA的解旋、G4 DNA的解旋等一系列DNA代谢过程，明确了RecQ对双链DNA与G4 DNA的解旋机制。与此同时，本研究证实了HRDC结构域在RecQ对DNA代谢过程中的影响及其作用机制。