论文部分内容阅读
甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)作为一类广泛应用于汽油添加剂的有机小分子,近年来的职业暴露和环境暴露日益增多。研究表明甲基叔丁基醚在细胞水平及整体动物水平对生物体产生毒性作用,其潜在的毒性和生物学效应包括急性毒性、生殖毒性、遗传毒性、致癌性、细胞凋亡及氧化应激等,但其毒性作用机制不明。本研究结合毒理学研究方法和蛋白质组学技术,探讨MTBE诱导中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞的氧化应激效应和蛋白质组的改变,在分子水平探讨MTBE的潜在毒性作用。本论文主要开展了以下两部分的研究工作:1.MTBE对CHO细胞的体外毒性作用及氧化应激效应培养CHO细胞,使用不同浓度(0~100 mmol/L)的MTBE处理CHO细胞6h、12h、24h,MTT法观察细胞的增殖抑制作用,确定MTBE作用CHO细胞剂量-效应关系。设置空白对照组,以0.5 mmol/L、5.0 mmol/L、25.0 mmol/L、50.0 mmol/L和100 mmol/L为处理组,处理时间均为12 h,用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)生成量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力等氧化应激相关各项指标,同时运用荧光定量PCR和Western blot技术检测氧化应激相关基因和蛋白表达水平。研究发现:处理后的CHO细胞,其存活率下降,并呈剂量-效应关系;同时LDH漏出,MDA含量都随MTBE剂量的增大而升高,且呈现剂量-效应关系,但ROS生成量却随MTBE剂量的增大而降低,SOD、CAT及GSH酶活力都呈升高趋势。此外,随着MTBE浓度的升高,SOD1、CAT、GPX-1的基因和蛋白表达水平与对照组相比都有不同程度的升高。这一结果也与前期的相关酶活力的变化趋势呈现很好的一致性。因此,MTBE暴露可以抑制CHO细胞增殖并引起氧化应激效应,提示氧化应激效应可能参与MTBE致CHO细胞的毒性作用。2.MTBE致CHO细胞毒性作用的蛋白质组学研究参考确定的剂量-效应关系,MTBE暴露以0 mmol/L、5.0 mmol/L和100.0mmol/L 3个剂量对CHO细胞进行12 h处理,制备蛋白样品进行荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE),对差异表达蛋白进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定并进行生物信息学分析,再使用Western blot对差异蛋白进行进一步的验证。研究发现:通过2D-DIGE和MALDI-TOF-MS/MS质谱技术,测定了在MTBE处理下CHO细胞蛋白质组的差异表达,共鉴定出24个蛋白,与对照组相比,有16个蛋白的表达上调,8个蛋白的表达下调。对这些差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出4个与细胞毒性以及氧化应激相关的蛋白分子,分别为:Stress-70 protein,mitochondrial(GRP75)、Heat shock cognate 71 kDa protein(HSC70)、40S ribosomal protein SA(RPSA)和Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(PPIA),通过Westernblot进行蛋白验证,其表达变化情况与CHO细胞蛋白质组学的实验结果相符合。因此,MTBE暴露可以诱导CHO细胞蛋白表达水平的变化,这些氧化应激相关蛋白表达水平的改变可能是MTBE致CHO细胞毒性作用的重要组成部分。