论文部分内容阅读
多不饱和脂肪酸(polyunsaturate fatty acids,PUFAs)是人体必需的营养物质,对人体有至关重要的作用,一旦缺少就会导致各种疾病的发生,所以在营养及医药方面具有很重要的作用。α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)属于ω-3系列PUFAs,是合成二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)与二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的前体,在维持人正常生理功能中起着至关重要的作用。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)与单胞藻(Monodus subterraneus)是高产ω-3类PUFAs的两种微藻,ω-3类PUFAs生物合成途径中含有ALA合成的关键-Δ-15脂肪酸脱氢酶。本文以莱茵衣藻(C.reinhardtii)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,从中分别克隆了△-15脂肪酸脱氢酶全长基因,分别转化酵母和烟草,并进行了表达和生物学功能分析；同时完成了单胞藻的转录组测序和生物信息学分析,主要结果如下；
分别提取拟南芥嫩叶与莱茵衣藻对数期细胞的总RNA,经纯化后,采用RT-PCR方法扩增得到的片段与pMD19-T载体连接后,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经过PCR鉴定、样品测序、Blast分析,分别确定为莱茵衣藻的△-15脱氢酶基因(全长为1362 bp,编码419个氨基酸)和拟南芥的△-15脱氢酶基因(全长为1525 bp,编码447个氨基酸)。
把这两种△-15脂肪酸脱氢酶基因分别插入毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K中,电击转入毕赤酵母GS115菌株中,利用甲醇诱导毕赤酵母表达,经过RT-PCR检测、甲酯化毕赤酵母总脂肪酸并进行气相色谱分析,结果表明莱茵衣藻和拟南芥的△-15脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中均得到了表达,与转空载体的菌株相比,转△-15脂肪酸脱氢酶基因的菌株的亚油酸摩尔含量由44.3％下降至26.9％,同时ALA的摩尔含量相比转空载体的也有所提高,验证了△-15脂肪酸脱氢酶基因在体内的生物学功能,进而说明莱茵衣藻△-15脂肪酸脱氢酶是在亚油酸的距甲基端的第十五个碳原子处脱氢的,从而生成ALA。同时把两种△-15脂肪酸脱氢酶基因连接入植物表达载体pCAMBIA2300中,电击转化入根癌农杆菌LBA4404中。用含△-15脂肪酸脱氢酶基因的根癌农杆菌菌液侵染烟草叶盘,50 mg／L卡那霉素筛选出抗性芽,抗性芽生根。PCR检测△-15脂肪酸脱氢酶基因已经整合入烟草基因组中,RT-PCR检测表明△-15脂肪酸脱氢酶基因在烟草能够正常转录。
为克隆PLIFAs合成途径相关的高效新基因,对富含EPA的单胞藻(M.subterraneus)UTEX＃B151的转录组测序并且进行分析。序列经拼接得到26,903条ESTs,序列长度大于500 bp的有10,792条,经Blastx分析得到17,232个独立基因。在此基础上,Blastx分析数据库为KEGG,有5,270个独立基因与各种代谢途径能够匹配上,得到了34条与PUFAs合成相关的基因,包括关键的6种脱氢酶基因和4种延伸酶基因,为第二代转基因植物的脂肪酸优化和品质改良提供了优良的基因。