肠干细胞是决定肠上皮结构和功能的根源。乳磷脂作为母乳中特有的生物活性物质,在维护肠上皮稳态方面起着关键的作用。然而,由于缺乏合适的肠干细胞体外研究技术,以往关于乳磷脂肠生物学效应的研究均未深入到肠干细胞层面。近年来,随着三维（3D）肠类器官技术的出现,使得在体外长期维持肠干细胞的自我更新和分化成为可能。本课题基于小鼠肠类器官的体外培养,结合传统小鼠（疾病）动物模型,系统研究了乳磷脂对正常小鼠和不同病理（肠炎和沙门氏菌感染）状态下小鼠肠上皮的保护作用及机制,为乳磷脂的功能性应用提供进一步的理论基础。主要研究内容和结果如下:1.小鼠肠类器官体外培养。通过筛选合适的有效分离隐窝的EDTA浓度、培养基中R-spondin l的适宜浓度和高效的传代方式等技术关键点,分别实现了小鼠小肠（十二指肠、空肠和回肠）类器官和结肠类器官的成功体外3D培养,建立了小鼠肠类器官培养技术操作程序规范。所获得的小鼠小肠和结肠类器官的原代类器官平均形成率分别在70%和55%左右,二代类器官平均形成率分别为90%和70%左右,单个肠类器官平均扩增倍数分别约为10和12左右,单个小肠类器官的平均出芽数约为7～9个。通过免疫荧光染色对肠上皮各细胞类型标志基因（Chg A、DCLK1、Muc2、Lyz和Villin）蛋白做鉴定,证实了所获得的肠类器官具有肠上皮所有的细胞类型。同时,基于小肠3D类器官,优化实现了可增殖的、多样化细胞类型的、具有乳磷脂吸收和黏液分泌功能的肠上皮2D单层培养。2.乳磷脂对正常小鼠肠上皮稳态的影响。健康小鼠每日补充25 mg/kg的乳磷脂,连续24天,对小肠和结肠组织结构、肠上皮增殖、肠上皮细胞谱系分化都未见显著影响（p>0.05）。在结肠类器官中,乳磷脂对结肠干细胞增殖和分化也未见直接的显著影响（p>0.05）。3.乳磷脂对小鼠肠炎性结肠上皮损伤的保护作用和机制。乳磷脂补充（25 mg/kg/日,连续24天）可显著减轻DSS诱导的小鼠急性结肠炎,表现为:小鼠体重下降平均值从17.5%降至7.2%（p<0.05）,疾病活动指数平均值从2.89降至1.5（p<0.05）,结肠上皮损伤平均评分从10.3降至6.5（p<0.05）,髓过氧化物酶（MPO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子表达水平均显著下降（p<0.05）。乳磷脂通过显著降低肠黏膜下层肌成纤维细胞中Notch受体的配体Dll4的过度表达（从4.8倍降为2.3倍,p<0.05）,恢复结肠上皮中过度激活的Notch信号通路水平,显著减轻了急性结肠炎引起的杯状细胞耗竭（p<0.05）:单个隐窝中杯状细胞数由平均10.2个升至19.3个,杯状细胞平均直径由10.4μm增至14.5μm。同时,结肠上皮的Muc2粘蛋白分泌水平显著升高近11倍（p<0.05）,Reg3β、Reg3γ和Ang4抗菌肽基因表达均显著升高3～8倍不等（p<0.05）,从而增强了肠黏膜非特异性免疫,对肠炎性结肠上皮损伤起到了保护作用。通过结肠类器官单培养和肌成纤维细胞-结肠类器官共培养体系的研究发现:乳磷脂对结肠干细胞的增殖影响不显著（p>0.05）,但显著促进了结肠干细胞的杯状细胞分化（p<0.05）:单个结肠类器官平均杯状细胞数由6.8升至17.6个。并且乳磷脂的这种结肠干细胞分化调控必须要有结肠干细胞龛因子肌成纤维细胞的介导,是一种间接调控。4.乳磷脂对小鼠肠炎性回肠上皮损伤修复的影响和机制。乳磷脂（25 mg/kg/日）在肠炎性回肠上皮损伤修复期的补充,促进了回肠上皮的损伤修复,表现为:回肠上皮组织结构损伤恢复度得分由1.2升至2.8（p<0.05）;紧密连接蛋白ZO-1和钙黏附蛋白（E-Cadherin）表达的显著回复（p<0.05）;显著提高回肠上皮损伤修复过程中肠上皮细胞的增殖率约1.8倍（p<0.05）和迁移速度约1.5倍（p<0.05）,但对细胞凋亡未见显著影响（p>0.05）。在TNF-α损伤的回肠类器官中,乳磷脂可直接作用于回肠干细胞,通过上调Wnt/β-catenin信号通路,显著上调+4储备回肠干细胞（Bmi1+）数约3.2倍（p<0.05）,进而补充因损伤而减少的Lgr5+隐窝基底柱状细胞数约2.8倍（p<0.05）,同时平衡回肠干细胞的分化失衡,从而促进肠炎性回肠上皮的损伤修复和稳态维持。5.乳磷脂对沙门氏菌感染下小鼠肠黏膜微生物屏障的影响和机制。小鼠适量乳磷脂补充（0.05%）可显著提高由肠道菌群介导的小鼠沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）定植抵抗力,主要表现为:小鼠体重下降平均值由25.7%降至12%（p<0.05）,结肠和盲肠内容物减少平均值从56.3%降至26.6%（p<0.05）,结肠上皮组织学损伤明显转轻（p<0.05）,MPO活性和TNF-α等促炎细胞因子水平显著下降（p<0.05）,沙门氏菌粪便排出量（p<0.05）和组织定植量（p<0.05）分别显著降低约2个和1个数量级。然而,过量补充乳磷脂（0.25%）,则加剧了小鼠沙门氏菌感染。基于16S r RNA基因高通量测序分析小鼠肠道菌群显示:小鼠沙门氏菌感染下,适量乳磷脂补充只显著影响肠道菌群的组成（β-多样性,p<0.05）,对肠道菌群的α-多样性（Chao1指数和Simpson指数）影响不显著（p>0.05）。LEf Se分析和随机森林建模分析得出:拟杆菌类群中的卟啉单胞菌科（Porphyromonadaceae）、拟普氏菌属（Alloprevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）是预测能力等级最高的中等剂量乳磷脂补充下小鼠肠道微生物群特征。中等剂量乳磷脂补充使得小鼠结肠中丙酸水平显著升高约3倍（p<0.05）。Spearman相关性分析显示:拟杆菌（Bacteroidales spp.）和丙酸与结肠炎相关指标呈显著负相关（p<0.05）。因此,拟杆菌（Bacteroidales spp.）和丙酸相对丰度的显著增加可能是中等剂量乳磷脂补充改善小鼠沙门氏菌感染的主要原因之一。在沙门氏菌感染的小鼠结肠类器官中,进一步证实了乳磷脂对沙门氏菌的结肠类器官定植没有直接的显著影响（p>0.05）,而脆弱拟杆菌（Bacillus fragilis）及丙酸均显著抑制沙门氏菌的结肠类器官定植（p<0.05）,丙酸还显著促进了沙门氏菌感染的结肠类器官中结肠干细胞的杯状细胞分化（p<0.05）:单个结肠类器官平均杯状细胞数由7.6升至19.3个。这些结果提示:适量乳磷脂补充所调控的肠道拟杆菌及其代谢产物丙酸可直接降低沙门氏菌的结肠上皮定植,是其显著改善小鼠抗沙门氏菌感染可能的机制之一。综上所述,乳磷脂的肠上皮生物学效应强烈地取决于机体的状态,对正常小鼠和不同病理状态下小鼠肠上皮和肠干细胞有着不同的影响,且对不同肠段肠上皮的干细胞影响机制也不相同。本研究构建的体外肠类器官与供体动物的实验结果一致性极高,两者可以互为补充和深入,为食品营养生物学研究提供了新的研究平台。