背景： 急性肝功能衰竭(Acute livet failure，ALF)是以快速进展的肝性脑病和严重的肝功能损害为特征的严重肝功能障碍疾病，死亡率高达70～80％，是目前医学上最难解、最棘手的征候之一。目前对于ALF尚缺乏有效的治疗手段。原位肝移植(Orthotopic liver transplantation，OLTx)是目前治疗ALF最有效的方法，但由于其供肝短缺，移植前需建立合理安排供肝的一系列指标，移植后供肝有被肝炎病毒感染的可能，终身服用免疫抑制剂治疗及手术高额费用，决定了其在我国难以广泛应用。人工肝支持系统(Artificial liver support system，AL,SS)是一种替代治疗方法，其中非牛物ALSS虽已被广泛使用，但未证实其能确切有效提高ALF的生存率；以体外培养的肝细胞为核心组成的生物学ALSS则是理想的治疗方法，但因供肝细胞来源、生物反应器的选择和性能、高费用以及其治疗过程中可能产生的血流动力学紊乱、再出血的弊端制约其应用。另一种替代治疗则是肝细胞移植(Hepatocyte transplantation，HTx)技术，也因存在细胞来源及移植细胞疗效的滞后性影响其应用。积极寻找安全有效、费用低廉的新型治疗手段已成为当务之急。构建供移植治疗使用的人工肝组织(Engineered livertissue，EHT)是目前研究的前沿，相比AL,SS，EHT更具有可操作性、低费用及高安全性。目前构建EHT主要困难在于：种子细胞的获得、支架的选择、培养模式及对EHT营养获取的调控方面。其中尤以种子细胞获得为主要制约因素。 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是指骨髓中一群具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、肌腱细胞等多种细胞分化潜能的多能干细胞。由于其取材容易、在体外易分离和扩增培养，在长期培养过程中，始终保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，自体移植可避免免疫排斥反应，是组织工程学和创伤愈合研究中的理想种子细胞，在医学领域具有广泛的应用前景。在最近几年内，一系列令人振奋的研究报道突破了传统认为MSC不能跨胚层分化的观点，拓宽了MSC向三个胚层的分化潜能。本研究就MSC在体外诱导肝样细胞并构建MSC源性EHT作初步探索，旨在探讨MSC源性EHT治疗ALF的可能性。 目的： 建立Sprague-Dawley(SD)大鼠MSC的体外分离、培养及扩增的方法。探索在体外经肝细胞生长因子(Hepatic growth factor HGF)和表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)联合作用下，诱导MSC向肝样细胞方向分化的可能性。并以其为细胞核心，在特殊的Transwell三维培养系统中与一定的生物支架相结合构建EHT，并移植治疗ALF大鼠，为临床上开展利用MSC源性EHT治疗ALF提供前期实验资料。 方法： 采用Percoll密度梯度离心结合贴壁法筛选大鼠MSC，扩增获得高质量的MSC。取生长良好的细胞进行形态学观察、染色体检测、生长曲线测定、细胞周期检测，并应用流式细胞分析及多向分化潜能实验鉴定MSC。取P3代MSC，经CM-Dil标记后，在含20ng/mlHGF+10ng/mlEGF细胞因子培养基中连续培养21天，分别于7、14、2l天收集标本进行倒置相差显微镜观察、免疫荧光检测和RT-PCR分析。取上述培养基培养14天的MSC，接种在预置含有去细胞羊膜基质、DACRON PATCH心血管补片或生物外科补片的Transwell 24孔培养板底，在Transwell体系中继续培养3天，以构建3种EHT。分别用电镜观察、免疫荧光检测和尿素合成实验对3组EHT进行形态学与功能学检测，筛选出最佳EHT供移植用。行90％肝组织切除制作大鼠ALF模型，将筛选出的最佳EHT移植入ALF大鼠中，通过大鼠牛存时间、肝性脑病及肝功能检测评估其治疗作用，并取移植组残存肝脏组织切片行激光共聚焦显微镜检查。 结论： 利用Percoll密度梯度离心结合贴壁法分离MSC，可获得高纯度高质量的MSC，细胞在体外连续培养至10代仍保持旺盛的增殖能力和稳定的遗传性能。MSC体外含HGF和EGF的培养基中有诱导MSC向肝样细胞诱导分化的趋势，并以此为核心在Transwell三维立体培养体系中与一定的支架材料相结合构建出EHT。经移植后证实有助于治疗ALF，为探索将来应用新型种子细胞和新型生物支架材料结合构建EHT治疗ALF提供了实验基础。