乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤,全球每年约有120万妇女患乳腺癌,50万人死于乳腺癌。自20世纪70年代末开始,乳腺癌的发病在全球范围内居女性肿瘤的首位。并以每年20%的速度递增。手术、放疗、化疗、激素治疗是乳腺癌治疗的常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织,特别是伤害机体的免疫系统。目前,随着分子生物学、分子遗传学的研究进展,乳腺癌的基因治疗日益受到人们的重视,显示出良好的应用前景。　　 基因转运技术是基因治疗的重要环节之一,寻找合适的基因运载体一直是人们的研究热点。腺病毒载体因具有宿主范围宽广、感染效率高、可插入外源基因片段大、病毒相对容易制备和不会与感染细胞发生整合等诸多优点而受到特别重视,成为肿瘤基因治疗中应用最为广泛的载体系统。　　 寻找有效且具有普遍抗肿瘤作用的治疗基因一直是肿瘤基因治疗研究的重点之一。CRT最初被认为是内质网钙结合蛋白,但随着研究的不断深入,发现它是多功能蛋白质,在新生蛋白质的加工与折叠、抗原的提呈、血管的发生及细胞凋亡中发挥着重要的作用,近年来发现其在多种肿瘤的侵袭转移中都扮演着重要的角色。MAGE-A3作为MAGE家族重要成员之一,被证实在除睾丸组织外的正常组织中不表达,而广泛表达于多种肿瘤组织。已有研究证实家族内其他成员,如MAGE-A4能够启动非小细胞肺癌的凋亡,MAGE-D1是新型的内源性血管生成抑制剂。但对于MAGE-A3在肿瘤发生发展过程中作用的研究尚未有报道。　　 本课题主要是基于重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3就乳腺癌基因治疗开展了相关的工作,一系列的体内外实验结果证实转染Ad-CRT/MAGE-A3能够抑制乳腺癌的生长、侵袭及血管形成,从而为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 细胞株及实验动物　　 人胚肾细胞293LP、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人脐静脉内皮细胞HUVEC购自中国科学院上海生物研究所细胞库。4-5周龄BALB/c nu/nu裸鼠,体重18-20克,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。　　 二、主要研究方法　　 1、重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3的构建及鉴定。　　 NheⅠ/PmeⅠ酶切穿梭载体pShuttle-GFP-CMV,以pFlag-CMV2-CRT质粒为模板,设计并合成引物扩增目的基因CRT,经NheI/PmeI酶切后与穿梭载体连接;BglⅡ/XhoⅠ酶切重组穿梭载体pShuttle-(AGFP)-CRT,以pCDNA3.1(-)-MAGE-A3质粒为模板,设计并合成引物扩增目的基因MAGE-A3,经BglⅡ/XhoⅠ酶切后与重组穿梭载体连接;Ⅰ-CeuI+Ⅰ-SceⅠ双酶切处理pAdxsi载体,Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-Scel双酶切处理pShuttle-CRT/MAGE-A3后将插入片段与载体片段连接,卡那抗性筛选提取后酶切鉴定;鉴定正确的腺病毒载体经PacⅠ限制性内切酶线性化后转染293LP细胞扩增、纯化及滴度测定;Western blot法检测检测转染48h后MDA-MB-231细胞中CRT及MAGE-A3蛋白表达。　　 2、MTT法检测MDA-MB-231细胞的增殖。　　 3、AnnexinV-FITC/PI检测MDA-MB-231细胞的凋亡。　　 4、Transwell实验检测MDA-MB-231细胞的侵袭。　　 5、Tube formation实验检测HUVEC细胞的成管。　　 6、裸鼠移植瘤模型的构建。　　 7、乳腺癌裸鼠瘤体标本CD34的表达。　　 8、Western blot法检测MDA-MB-231细胞中P13K、p-Akt、NF-KB、CyclinD1、Bcl-2、MMP-9及IκBα蛋白的表达。　　 9、统计学处理:所有数据均用SPSS13.0软件进行统计分析,所得结果用均数±SD表示,采用ANOVA分析。P＜0.05认为有显著性差异并在统计学上有意义。　　 结果：　　 1、NheⅠ/PmeⅠ酶切穿梭载体pShuttle-GFP-CMV,以pFlag-CMV2-CRT质粒为模板,设计并合成引物扩增目的基因CRT,经NheⅠ/PmeⅠ酶切后与穿梭载体连接,卡那抗性筛选提取后测序正确,酶切鉴定结果显示连接成功;BglⅡ/XhoⅠ酶切重组穿梭载体pShuttle-(△GFP)-CRT,以pCDNA3.1(-)-MAGE-A3质粒为模板,设计并合成引物扩增目的基因MAGE-A3,经BglⅡ/XhoⅠ酶切后与重组穿梭载体连接,卡那抗性筛选提取后测序正确,酶切鉴定结果显示连接成功;Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-SceⅠ双酶切处理pAdxsi载体,Ⅰ-Ceul+Ⅰ-ScaⅠ双酶切处理pShuttle-CRT/MAGE-A3后将插入片段与载体片段连接,卡那抗性筛选提取后酶切鉴定,结果显示连接成功;鉴定正确的腺病毒载体经PacⅠ限制性内切酶线性化后转染293LP细胞扩增、纯化及滴度测定,病毒滴度为2×107PFU/μl;Westernblot法检测证实转染48h后MDA-MB-231细胞中CRT及MAGE-A3蛋白表达。　　 2、MTT检测结果显示,与未转染、转染Ad载体、转染Ad-CRT载体及转染Ad-MAGE-A3载体相比,转染Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖。　　 3、AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检测结果表明,转染后48h,与未转染、转染Ad载体、转染Ad-CRT载体及转染Ad-MAGE-A3载体相比,转染Ad-CRT/MAGE-A3具有诱导MDA-MB-231细胞凋亡的效果。　　 4、Transwell实验结果进一步证实转染Ad-CRT/MAGE-A3能够显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。　　 5、Tube formation实验结果证实转染Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制HUVEC形成血管的能力。　　 6、裸鼠移植瘤模型抗瘤活性实验表明瘤体内注射Ad-CRT/MAGE-A3能有效抑制瘤体的生长。　　 7、对裸鼠移植瘤的免疫组化检测显示,与对照组、Ad载体组、Ad-CRT载体组及Ad-MAGE-A3载体组相比,Ad-CRT/MAGE-A3组裸鼠移植瘤内CD34表达明显减少。　　 8、Western blot法检测MDA-MB-231细胞中PI3K,pAKT,NFκB及CyclinD1,Bcl-2,MMP-9,IκBα的表达。结果显示,转染Ad-CRT/MAGE-A3显著抑制了PI3K、p-Akt、NF-κB蛋白的表达,通路中相关蛋白CyclinD1,Bcl-2,MMP-9的水平与其他对照组相比亦显著降低,而NF-κB的抑制因子IκBα水平升高。　　 结论：　　 本实验研究采用一系列体外实验和体内实验,体外实验结果显示Ad-CRT/MAGE-A3转染MDA-MB-231细胞能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性,侵袭活性,并能够诱导其凋亡,同时能够明显抑制内皮细胞HUVEC细胞形成血管的能力;同时,体外实验结果显示,转染Ad-CRT/MAGE-A3显著抑制了PI3K、p-Akt、NF-κB蛋白的表达,通路中相关蛋白CyclinD1,Bcl-2,MMP-9的水平与其他对照组相比亦显著降低,而NF-κB的抑制因子IκBα水平升高。我们推测Ad-CRT/MAGE-A3可能通过抑制PI3K/pAKT/NF-κB这一信号通路进而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭,并诱导其凋亡。体内实验结果显示通过瘤体内注射Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制裸鼠体内乳腺癌细胞的生长及瘤体内血管的生成。综合体内外实验结果得出,重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制乳腺癌细胞的肿瘤源性,为探寻乳腺癌基因治疗的新思路提供了实验基础。