研究背景及意义：支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性呼吸道炎症性疾病之一,研究显示,全球哮喘病人约3亿多,我国约有3000万,而且仍有不断增加的趋势。尽管通过全球哮喘防治创议(GINA)推荐的规范化治疗,大部分哮喘病人的临床症状可得到有效控制,但并不能抑制疾病潜在的发展,因此探讨哮喘的发病机制,进一步寻找治疗靶点具有重要的意义。气道上皮细胞(AEC)作为气道抵御外来环境刺激的第一道防线,在维持气道内环境的平衡和稳定中发挥重要的作用,在哮喘气道炎症的启动和维持中扮演关键角色。虽然支气管哮喘是以TH-2型炎症为主的气道慢性炎症炎症性疾病,但其疾病的进程及对外界环境刺激因素的高度敏感却不能单纯从炎症的角度来解释。有研究表明：哮喘患者存在上皮屏障功能受损,在哮喘患者中气道上皮细胞紧密连接及粘附连接蛋白的表达量较正常人减少,且与嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润有关。气道上皮结构及屏障功能的破坏,即上皮细胞间紧密连接等结构蛋白的破坏可导致外界抗原轻易地通过气道壁粘膜屏障,与粘膜下DC细胞等免疫细胞接触,从而诱发细胞因子、生长因子等炎症因子释放增加,通过与粘膜下间质细胞相互作用,可诱导平滑肌细胞增生、气道重塑,从而引起更强更持久的慢性炎症反应。职业性哮喘(Occupational Asthma)是工业化国家最常见的工作相关的肺疾病(Work-related lung disease),其发病比例约占成人哮喘患者的15%。据统计,异氰酸盐类是引起职业性哮喘最常见的原因,常见的异氰酸盐包括甲苯二异氰酸盐(Toluene Diisocyanate, TDI)、二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、己二异氰酸酯(HDI),其中,由于价格相对较低等优势,TDI的应用最为广泛,主要用于生产软质聚氨酯泡沫及聚氨酯弹性体、涂料、胶黏剂等,在建筑、家居、各种室内外装修中广泛使用。长期暴露于TDI环境的人群,最终约有5%～15%发展为哮喘,而在普通人群中,哮喘的发病率约为0.1%～8%,我国约为0.11%～2.03%。鉴于其高发病率及所带来的巨大社会和经济负担,TDI所致的职业性哮喘已引起高度重视,目前认为其发病机制涉及免疫系统相关和非免疫系统相关等途径,暴露人群中的基因易感性可能也参与了TDI哮喘的发病,但相关领域的机制研究还比较局限,许多方面还不清楚,因此进一步研究其作用环节及寻找新的诊断、治疗手段至关重要。TDI的结构特点是含有活性很高的N=C=O基团,使其成为一种反应活性极强的化学物质,这一特点使其广泛应用于工业生产中,同时这种高反应性也使其具有较大毒性,也是导致职业性哮喘的重要结构基础。TDI作用与人体的重要靶点即气道上皮细胞,其与AEC之间的相互作用在TDI哮喘的发病中具有重要地位。研究表明：气道上皮单层的屏障结构和其保护作用可以被异氰酸盐所损坏,高浓度异氰酸盐的暴露可以诱导气道上皮细胞固缩、DNA碎裂,紧密连接及缝隙连接蛋白解体、电阻改变甚至细胞的死亡。我们实验室既往研究也表明：在体外试验中,TDI-HSA复合物在不影响细胞活力的情况下,可引起气道上皮细胞系(16HBE)细胞通透性的增加,该通透性的改变与血管内皮生长因子(VEGF)的释放有关。但是TDI对于气道紧密连接蛋白、粘附连接蛋白(E-钙粘蛋白)等的影响并不清楚,在体内TDI对于气道屏障功能及气道上皮细胞间连接蛋白的破坏作用也有待阐明。糖皮质激素是目前哮喘治疗的一线药物,主要取决于其强大的抗炎作用,糖皮质及素可以减轻炎症细胞浸润及抑制多种炎症因子的表达,例如,它可以通过作用于气道上皮细胞的糖皮质激素受体,抑制气道上皮细胞释放多种炎症因子,近期研究亦表明糖皮质激素可通过EGFR受体途径作用与气道上皮细胞,引起正常状态下气道上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1等重新分布,有增强上皮间屏障功能的作用。但是在损伤状态下,糖皮质激素是否具有上皮屏障修复作用尚不清楚。因此探讨致敏状态或损伤状态下,糖皮质激素对气道上皮细胞屏障功能的保护作用非常重要和必要,这可能为糖皮质激素运用于哮喘治疗提供新的证据,同时为哮喘的治疗找到新的治疗靶点。本研究拟在前期体外实验证明TDI-HSA可引起气道上皮通透性增加的基础上,在体内外模型中探讨TDI对气道上皮E-钙粘蛋白的表达和分布变化,进一步探讨糖皮质激素在其中的保护作用及可能的作用机制。研究方法：一：动物实验1、建立稳定的TDI诱导的职业性哮喘小鼠模型。实验分组：正常对照组(溶剂致敏,溶剂激发)、TDI哮喘组(TDI致敏,TDI激发)和地塞米松治疗组(TDI致敏,TDI激发,激发前一天开始腹腔注射地塞米松,连续给药8天)。观察各组小鼠的一般状态,是否出现哮喘症状及严重程度程度。2、利用无创肺功能仪检测各组小鼠气道反应性情况：使用不同浓度乙酰甲胆碱(0,3.125,6.25,12.5, and25mg/ml溶解在0.9%生理盐水中)激发,利用BUXCO无创肺功能检测仪检测Penh值。3、耳后淋巴结的培养,血清总IgE的测定：取小鼠耳后淋巴结,分离出淋巴细胞体外培养,培养液上清检测IL-4、IFN-γ。血清检测总IgE水平。4、小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数：PBS灌洗,灌洗液离心沉淀细胞计数,苏木素-伊红(HE)染色进一步行细胞分类计数。5、小鼠肺脏组织的病理观察：取出小鼠肺组织,固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木素—伊红(HE)染色观察小鼠肺脏病理变化。6、取小鼠肺脏组织行免疫组化及western blotting检测,观察E-cadherin在气道上皮的表达及分布情况。二：细胞实验1、制备TDI-HSA抗原结合物：应用改良的Son M方法制备TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)。应用Son et al.’s assay方法测定复合物中TDI及HSA结合比。2、四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的TDI-HSA及HSA对正常人支气管上皮细胞株16HBE-14o细胞活力的影响。分组情况：正常对照组(不加TDI-HSA,只以无血清培养基孵育),TDI-HSA20ug/ml、TDI-HSA40ug/ml、 TDI-HSA60ug/ml、TDI-HSA100ug/ml, HSA20ug/ml、HSA40ug/ml、HSA60ug/ml、HSA100ug/ml按上述分组刺激16HBE24h后,用MTT比色法检测细胞活力。3、观察不同浓度TDI-HSA对16-HBE E-钙粘蛋白表达及分布的影响,分组情况：正常对照组(不加TDI-HSA只以无血清培养基孵育),HSA对照组(HSA100ug/ml), TDI-HSA40ug/ml组,TDI-HSA60ug/ml组,TDI-HSA100ug/ml组,按上述分组刺激16HBE24小时后,行免疫荧光检测不同浓度TDI-HSA刺激下气道上皮细胞E-钙粘蛋白的分布情况、Western blotting检测E-钙粘蛋白总的表达水平。4、观察地塞米松及ERK通路抑制剂对TDI-HSA所致的E-钙粘蛋白破坏是否具有保护作用。实验分组：正常对照组,HSA对照组(HSA100ug/ml), TDI-HSA100ug/ml组,地塞米松预处理组(10-4M或10-6M),ERK通路抑制剂预处理组(PD9809510-7M),地塞米松单独刺激组(10-4M或10-6M)。地塞米松及ERK通路抑制剂均预处理细胞1小时。按上述分组刺激16HBE24小时后,分别行Western blotting及免疫荧光检测E-钙粘蛋白的表达水平及分布情况。5、观察TDI-HSA刺激下,16HBE ERK通路的活化情况及地塞米松对其干预作用。实验分组：正常对照组(不加TDI-HSA,只以无血清培养基孵育),HSA100ug/ml组,TDI-HSA100ug/ml组,地塞米松预处理组(10-6M),按上述刺激分组后,分别于刺激10分钟及30分钟时收取细胞,Western blotting检测p-ERK及total-ERK水平。6、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示,方差齐时,总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法,方差不齐时总体均数的比较采用Welkch法,各组间多重比较采用Tamhane’s T2检验,以P<0.05具有统计学意义。结果：一：动物实验部分结果1、TDI哮喘组小鼠在激发后可出现呼吸困难的临床表现,地塞米松治疗组小鼠的症状可部分缓解。随着乙酰甲胆碱浓度上升,各组小鼠气道反应性检测指标Penh值均出现上升趋势。TDI哮喘组小鼠的气道反应性最高。12.5、25mg/ml乙酰甲胆碱激发时,TDI哮喘组Penh值与对照组相比,有显著差异(P<0.001,P<0.001)。相对于TDI哮喘组,12.5及25mg/ml乙酰甲胆碱激发时,地塞米松治疗组小鼠气道反应性明显下降(P<0.001,P=0.02)。2、TDI哮喘组小鼠耳后淋巴结培养液中,IL-4及IFN-y浓度较对照组明显增高(P<0.001,P<0.001)。相对于TDI哮喘组,地塞米松治疗组IL-4及IFN-y浓度显著降低(P<0.001, P=0.001)。TDI哮喘组血清总IgE水平与对照组相比显著增高(P<0.001)。相对于TDI哮喘组,地塞米松治疗组可显著降低血总1gE水平(P<0.001)。3、支气管肺泡灌洗液中细胞分类计数结果：地塞米松可抑制TDI所致的支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞增加(P=0.031),对总细胞数、淋巴细胞数及巨噬细胞数无明显影响。相对于正常对照组组,TDI组小鼠BALF中性粒细胞比例显著增加(P=0.017),地塞米松治疗组进一步显著增加中性粒细胞比例(P=0.026)。小鼠肺组织病理可见：TDI组小鼠肺组织炎症细胞浸润明显增高,同时伴随气道上皮细胞的增殖及部分上皮的脱落。地塞米松可显著抑制支气管周围及血管周围的炎症反应。4、免疫组化结果显示：正常对照组小鼠,E-钙粘蛋白多连续分布于气道上皮细胞近管腔面,TDI组小鼠气道上皮细胞间E-钙粘蛋白分布显著减少、排列紊乱、向胞浆内弥散较多,在地塞米松治疗组,TDI所致的以上改变有部分恢复。二、细胞实验部分结果1、不同浓度TDI-HSA及不同浓度HSA对16HBE细胞活力的影响：TDI-HSA浓度为20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、100ug/ml及HSA浓度为20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、100ug/ml时对细胞活力均无显著影响(P=0.78)。2、不同浓度TDI-HSA对16HBE E-钙粘蛋白分布及表达的影响：免疫荧光显示：在正常16HBE及单独HSA处理细胞,E-钙粘蛋白多沿胞膜连续分布于细胞间连接处,不同浓度TDI-HSA (40ug/ml,60ug/ml,1OOug/ml)处理24小时后,细胞间连接处E-钙粘蛋白的完整性遭到破坏,向胞浆中弥散增多,且以上分布的改变呈浓度依赖趋势。Western blotting检测E-钙粘蛋白总的表达水平,在各组间无显著差异(P=0.99)。3、地塞米松及ERK通路抑制剂对TDI-HSA所致E-钙粘蛋白破坏的影响：相对于TDI-HSA处理组,地塞米松(10-4M,预处理1小时)预处理组及ERK抑制剂(PD9809510-7M预处理1小时)预处理组,E-钙粘蛋白的分布及结构改变可部分被逆转。Western blotting所见,各组E-钙粘蛋白总表达量无明显改变(P=0.79)。4、TDI-HSA对ERK通路活化水平的影响及地塞米松对其干预作用：TDI-HSA100ug/ml刺激16HBE10分钟及30分钟,western blotting可见p-ERK水平显著增加(P<0.001,P=0.03),尤其以10分钟时作用最显著。地塞米松预处理组(10-6M,预处理1小时)可显著抑制TDI-HSA所诱导的p-ERK水平(刺激10分钟时P=0.034,刺激30分钟时P=0.025)。结论：1、在TDI哮喘小鼠模型及16HBE细胞实验均证明,TDI可显著诱导气道上皮细胞E-钙粘蛋白分布的改变。但对E-钙粘蛋白总的表达量无显著影响。2、TDI在动物模型及细胞水平均可诱导气道上皮ERK通路的活化。体外ERK通路抑制剂(PD98095)可显著抑制TDI所致的气道上皮细胞E-钙粘蛋白分布的改变。3、地塞米松可通过抑制ERK活化水平,减弱TDI所致的E-钙粘蛋白分布的改变。4、地塞米松治疗可减轻TDI哮喘小鼠的呼吸困难的临床症状、气道高反应性、支气管血管周围的炎症浸润及上皮细胞脱落,可减少肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例,但却使中性粒细胞比例进一步增加。