肿瘤的形成过程是一个多阶段的、复杂的过程并且涉及基因内和基因外的多种改变,其中就包含基因机制(genetic mechanism)和表观基因机制(epigenetic mechanism)两大类机制。基因机制就包括了基因突变、染色体丢失和重排,产生了结构异常的基因产物；而当肿瘤细胞能转移时,它便获得了更多新的能力,例如在循环中的活动力、侵袭力及存活力；这同样是一个多阶段的、复杂的过程并同样涉及基因内与基因外的多种改变。近年来多个研究表明SATB1基因在肿瘤的进展和转移过程中担任着重要的角色,SATB1基因的改变可能引起超过1000个基因的变化,进而影响肿瘤的转移这一复杂过程,并且SATB1增量调节有可能是肿瘤细胞发生转移必须的基因簇的开关。伴随着人类基因组计划的完成,各种基因的筛选已成为目前基因研究的热点,而探索肿瘤进展和转移的相关基因对判定肿瘤的预后、指导治疗措施的选择及研发新的治疗措施和方案都具有重要的指导意义。研究背景膀胱尿路上皮癌是我国最常见的膀胱肿瘤,目前对膀胱尿路上皮癌的诊断主要是依赖有创的膀胱镜检查及病理学活检。通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否出现肿瘤,可以明确肿瘤的数目、肿瘤大小、形态及发生部位。并且可以对肿瘤或可疑病变部位进行活组织病理学检查以明确诊断。而膀胱肿瘤通常为多灶性病变,其中原位癌可以类似炎症或者发育不良等病变,膀胱镜下表现为滤泡样改变或者是浅红色天鹅绒样粘膜改变,也可以表现为正常。单一的乳头状瘤,通常不主张常规行随机活检,因为发现其他部位原位癌的可能性较低。易复发是膀胱癌的一大特点,在行保留膀胱的肿瘤切除术后,即使定期实施膀胱腔内灌注化疗,仍会有10%-40%复发率,大部分还出现分级、分期的进展或者是发生转移。目前认为导致膀胱肿瘤术后较高复发率因素有：(1)膀胱癌病理类型是影响其局部复发的主要因素,特别是盆腔复发的危险性与肿瘤的病理类型直接相关；(2)膀胱肿瘤局部复发与原发肿瘤的分期、分级也有相关性,并按顺序依次递增；(3)膀胱肿瘤术后局部复发与原病变部位和切除范围有相关,开放膀胱肿瘤部分切除术中,位于顶部、前壁及侧壁的肿瘤显露较好,手术切除率高,局部复发率低,而三角区、底部、输尿管开口处因病变部位低,术野狭窄而且深,显露困难操作受限致切除范围不够深,而引起切缘癌组织残留导致癌术后复发；(4)术后不能进行正规的膀胱灌注及定期随访。因此,寻找一种特异性、敏感性较高,能够预判膀胱尿路上皮癌生物学行为的肿瘤标志物,作为判断膀胱肿瘤进展及转移潜在能力的指标,从而指导临床治疗方案的选择显得尤其重要。SATB1主要在胸腺细胞中显著表达,SATB1是一种组织特异性表达的核基质结合蛋白,它含有两个CUT基序,可以通过形成类似PDZ结构的二聚体,以非常高的亲和力与核基质结合区(MAR)序列相结合而影响了DNA环的构建,参与了包括染色体重塑、组蛋白乙酰化及甲基化等过程,并与DNaseⅠ超敏感位点(DNaseⅠhypersensitive site)具有较密切的相关性。研究表明SATB1的缺失至少会使小鼠全基因组2%的基因表达发生异常。SATB1参与了基因的转录抑制,在稳定整合的前提下会抑制与免疫球蛋白重链μ链增强子MAR相连的异源报告基因的表达。研究发现SATB1结合于小鼠乳腺瘤病毒末端重复序列(LTR)内的负调控元件上抑制了病毒基因的转录。SATB1对myc癌基因的表达也产生了影响。经比较SATB1移除前后的几种转移性细胞型中基因表达图谱的变化,表明SATB1控制了1/4-1/3“预后不良基因”,包括控制黏附性、细胞周期、细胞外基质、数个信号通路、细胞间连接及凋亡的基因。以往研究更显示,SATB1在染色体特定部位,使DNA折叠成为致密环从而影响染色质修饰蛋白和转录因子结合的作用；随后在这些部位的基因表达发生了多重后天性修饰和协同变化。因此,在细胞和遗传缺陷的变异细胞中,SATB1增量调节可能会是肿瘤细胞进展及转移必须的基因簇的开关。研究目的研究表明,SATB1在几种肿瘤中的表达是上调的,并且在恶性潜能高、容易进展及转移的肿瘤中是显著升高的,而且在肿瘤出现的早期即可检测到其变化。SATB1基因与乳腺癌转移的关系的研究最早也最为深入,Han等的一项研究表明,SATB1在乳腺癌进展过程中起到了关键性的作用,在高转移性乳腺癌的细胞株中检测出了SATB1mRNA及蛋白,且在恶性程度高的原发性乳腺癌样本都表达SATB1蛋白；结合临床对1318例乳腺癌患者的组织学样本进行了分析,结果表明SATB1表达高者生存期较短；在体外实验中,下调SATB1的表达不但逆转了细胞的侵袭力,而且抑制了肿瘤的生长,而异位的SATB1表达却使非侵袭性的细胞株获得了侵袭力。研究还证实SATB1蛋白的表达并不是局限于疾病的晚期,在乳腺癌早期、淋巴结转移之前也可以观察到它的存在。最新的关于SATB1基因与小细胞肺癌的转移的研究提示SATB1mRNA在小细胞肺癌组织中的表达水平比正常组织明显上调,表达量为正常组织13的倍,差异有显著性,提示SATB1基因表达与小细胞肺癌的发病也有一定关联,虽然其因果关系目前尚不清楚。SATB1mRNA在小细胞肺癌组织的表达水平与性别、年龄、组织学类型无关,但是与临床分期、病理分级、淋巴结转移显著相关,其中淋巴结转移组和非转移组的表达量分别为正常组织23.63倍和5.57倍,研究提示SATB1基因表达与小细胞肺癌的发展及侵袭有一定关联性。膀胱尿路上皮癌是我国最常见的膀胱肿瘤,目前对其的诊断主要是依赖有创的膀胱镜检查和病理学活检,易复发是它的一大特点,在行保留膀胱的肿瘤切除术后,即使是定期实行膀胱腔内灌注化疗,仍有10%-40%复发率,大部分还会出现分级、分期的进展或者发生转移,从而丧失根治手术的机会。目前对膀胱尿路上皮癌SATB1基因及其表达产物的研究未见报道,亦未见该基因与膀胱肿瘤生物学行为和临床参数关系的研究。我们实验研究的目的在于研究SATB1在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其与膀胱肿瘤生物学行为的关系。研究方法(1)采用免疫组化二步法检测68例膀胱尿路上皮癌及17例正常膀胱粘膜的SATB1表达：切片脱蜡、水化后进行抗原修复并清除过氧化物酶,切片加上1：100稀释的一抗SATB1,37℃120min, PBS洗2min×3次,滴加二抗工作液A液,37℃孵育20min, PBS洗2min×3次,滴加二抗工作液B液,37℃孵育20min, PBS洗2min×3次,DAB显色2-5min,显微镜下控制,自来水冲终止反应,苏木素复染约lmin,自来水冲蓝化5min,梯度酒精脱水二甲苯透明后中性树胶封片,用PBS代替一抗做为空白对照。结果判断由两名病理科医生采用盲法进行阅片的方式进行,并且结合北航图像分析系统软件来帮助进行结果判断。结果判定的标准：以细胞质出现棕褐色颗粒的细胞定为阳性细胞,每张切片选取5个高倍视野(×400倍),每个视野随机计数100个细胞,求其平均阳性率阳性细胞比例的均值≥25%为SATB1表达阳性。统计方法：应用SPSS13.0统计软件包对SATB1蛋白在68例膀胱癌患者中分别就年龄分组、性别分组、肿瘤分级分组及临床分期分组的阳性表达率数据进行分析处理,采用x2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。(2) RT-PCR法测定组织中SATB1mRNA表达取适量组织至新的1.5mlEP管中,用玻璃棒研磨,加入Trizol lml,充分振荡混匀,加入氯仿0.2ml,盖紧盖子,用力摇动15s,15-30℃孵育2-3min,4℃12000r/min离心15min,取上清液至新的1.5mL EP管,总RNA的提取步骤按照Trizol试剂的说明书进行,选择ACTB作为内参照基因,GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS区应用Primer express 2.0软件设计特异性引物,合成引物应用ABI 3900台式高通量DNA合成仪。逆转录反应：应用ABI 9700仪,取4μl RNA模板做逆转录反应,标准曲线定量法参照说明书制备阳性标准品及其梯度,阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。待测样本和阳性标准品进行荧光定量PCR反应,反应条件为：93℃3分钟,然后93℃30秒、55℃45秒、72℃45秒,共40循环。通过测量SATB1基因和内参照基因ACTB的扩增片断密度的比值,计算出SATB1基因的相对含量。应用SPSS13.0统计软件包对SATB1mRNA的相对表达含量在34例膀胱癌患者中分别就年龄分组、性别分组、肿瘤分级分组及临床分期分组进行分析处理,采用T检验,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果免疫组织化学检验结果表明,SATB1在癌组织中的表达阳性率为57.4%,高于正常组织23.5%的阳性率,进行卡方检验,χ2值为6.224,P值为0.013(P<0.05), SATB1在膀胱尿路上皮癌组织中表达的阳性率与性别、年龄、病理分级关系不明确,具体数值进行卡方检验)χ2值分别为0.363、0.176、1.882,P值分别为0.547、0.675、0.170(P＞0.05),但与临床分期及淋巴结转移相关,具体数值进行卡方检验χ2值分别为5.537、6.918P值分别为0.019、0.009 (P<0.05), RT-PCR检验结果表明,SATB1mRNA在癌组织中相对表达含量为0.105±0.064,而正常膀胱组织中的相对表达含量为0.017±0.007SATB1mRNA在癌组织中的表达水平比正常组织明显上调,进行两独立样本T检验,t值为-7.864,P值为0.000(P<0.001)差异显著,SATB1mRNA在膀胱尿路上皮癌组织中表达水平与年龄、病理分级关系不明确,具体数值进行两独立样本T检验,t值分别为0.372、-0.640,P值分别为0.717、0.528(P>0.05),但与临床分期、性别、淋巴结转移相关,具体数值进行两独立样本T检验,t值分别为-4.857、3.681、-6.685,P值分别为0.000、0.001、0.000(P<0.05),其中与临床分期、是否发生转移显著相关(P<0.001)。在同时进行了免疫组化及PR-PCR的标本中看到,SATB1蛋白表达阳性的标本其SATB1mRNA相对表达含量为0.144±0.059显著高于SATB1蛋白表达阴性的标本的SATB1mRNA相对表达含量0.055±0.023,具体数值进行两独立样本T检验,t值为5.997,P值为0.000(P＜0.001)。结果提示SATB1基因表达与膀胱尿路上皮癌的发生、发展及侵袭有一定关联性。研究结论1.膀胱尿路上皮癌组织中SATB1的表达阳性率明显高于正常膀胱粘膜组织,SATB1mRNA在癌组织中的表达水平比正常组织明显上调,表明SATB1在膀胱尿路上皮癌组织中存在过表达,对于膀胱尿路上皮癌的发生与发展有重要作用。2. SATB1在膀胱尿路上皮癌的发生和发展中可能起到促进作用,并且和临床分期、淋巴结转移都具有一定的相关性。