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第一部分RSV感染气道上皮细胞株TLR1-10 mRNA表达目的:为了解TLR家族在RSV诱导气道上皮细胞炎症反应中的作用,体外培养9HTEo人类气道上皮细胞株,观察RSV感染后,9HTEo细胞TLR 1-10 mRNA的表达变化。方法:RSV以MOI为10感染9HTEo细胞3小时后用半定量RT-PCR检测TLR1-10 mRNA表达;感染3、6和9小时后用Q-PCR检测TLR1-10 mRNA的动态变化,并以UV-RSV作为对照。结果:RT-PCR结果提示RSV感染上皮细胞后TLR2~10 mRNA表达均上调,以TLR2和TLR6变化最为显著;Q-PCR结果显示:(1)9HTEo细胞株可表达TLR1-10 mRNA,其中以TLR4和TLR8 mRNA表达最高;(2) RSV感染上皮细胞6小时和或9小时后,TLR1-10 mRNA均表达增高,而UV-RSV组TLR1-10mRNA无明显变化。结论:RSV感染气道上皮细胞株后,TLR1-10 mRNA均被上调,而无复制能力的RSV不能引起TLR1-10mRNA表达的变化,提示RSV诱导TLRs mRNA表达与病毒入胞复制有关。第二部分RSV感染后气道上皮细胞株TLR4蛋白表达及其功能研究目的:观察RSV感染后,气道上皮细胞TLR4蛋白表达变化及其信号通路的功能,与RSV在细胞复制的关系,进一步探讨RSV诱导气道炎症的可能机制。方法:体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-,RSV以MOI为10感染上皮细胞24小时后(1)用流式细胞术检测TLR4表达及与凋亡的关系;(2)用ELISA检测RSV感染上皮细胞经LPS刺激,并加入TLR4阻断剂HTA125后,上清液中IL-8,IL-6和RANTES的含量;(3)运用TLR4特异性的siRNA干扰9HTEo细胞TLR4表达后,接种RSV并予以LPS刺激,用ELISA法检测上清液中IL-8,IL-6的水平。用TLR4特异性siRNA干扰9HTEo细胞24小时后,①RSV以MOI为0.1感染细胞,连续3天收集上清液用Adeasy TCID50法检测RSV感染性滴度的变化;②RSV以MOI为10感染细胞48小时,ELISA方法检测上清液中IL-8,IL-6,TNF-α和MCP-1的变化;③RSV以MOI为10感染细胞24小时后,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:RSV感染9HTEo上皮细胞,膜上TLR4表达增高而胞内TLR4表达降低,TLR4阳性细胞百分比明显增加,其中绝大部分为膜Annexin V阳性细胞;LPS诱导的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻断,RANTES无明显变化;在TLR4表达被干扰的情况下,LPS刺激仅能诱导产生部分IL-8,不能诱导产生IL-6。TLR4-siRNA组的RSV滴度变化与正常9HTEo细胞组无统计学差异;RSV诱导的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA 200nM组明显低于对照组,而IL-8和TNF-α的水平无明显变化;TLR4-siRNA组RSV诱导AnnexinV阳性同时PI阴性的细胞群体百分比在TLR4-siRNA组明显高于对照细胞组。结论:RSV感染9HTEo细胞后,LPS再刺激产生IL-6是依赖于TLR4信号通路。气道上皮细胞TLR4通路与RSV复制、RSV诱导上皮细胞分泌IL-8无关,但与病毒诱导上皮细胞分泌IL-6和MCP-1,以及病毒感染细胞发生凋亡有关。第三部分RSV感染后气道上皮细胞株TLR3蛋白的表达及其功能研究目的:观察RSV感染9HTEo上皮细胞后, TLR3蛋白表达变化及其信号通路的功能。方法:体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-,RSV(1)以MOI为1感染上皮细胞24小时后,提取细胞总蛋白,用Westernblot的方法检测TLR3表达的变化,以TLR3激动剂PolyIC刺激为对照;(2)以MOI为10接种上皮细胞4小时后,直接加入PolyIC到培养上清或用脂质体将PolyIC转染至细胞内刺激48小时后,用ELISA检测上清液中IL-8,IL-6, IFN-α和IFN-β的表达。结果:RSV感染后9HTEo上皮细胞后,TLR3蛋白表达量明显增高,再经胞内TLR3激动剂PolyIC刺激后,培养上清IL-8,IL-6和IFN-β含量明显增加。结论:RSV诱导上皮细胞TLR3蛋白表达增高,TLR3通路可介导IL-8和IL-6和少量IFN-β产生,提示TLR3通路可能主要诱导上皮细胞炎症反应而不是抗病毒反应。第四部分白藜芦醇抑制RSV感染气道上皮细胞株炎症介质的产生及其机制研究目的:以地塞米松和利巴韦林为对照,观察白藜芦醇对RSV复制和对RSV诱导的上皮细胞炎症反应作用及其机制研究。方法:(1)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞和Hep-2细胞株,RSV以MOI为0.1接种Hep-2细胞和9HTEo细胞4小时后,加入适宜浓度的白藜芦醇,地塞米松和利巴韦林,连续5天收集各组上清液,用AdeasyTCID50方法检测计算RSV滴度的变化;(2)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞,RSV以MOI为10接种9HTEo细胞4小时,将PolyIC转染至细胞内后再加入适宜浓度白藜芦醇,地塞米松或利巴韦林至48小时后,用ELISA检测上清液中IL-8,IL-6的表达。(3)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞,RSV以MOI为1接种9HTEo细胞4小时,加入适宜浓度白藜芦醇,地塞米松或利巴韦林,48小时后收集细胞提取蛋白用Westernblot检测TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达的变化。结果:Hep-2细胞-白藜芦醇100μM处理组和9HTEo细胞-白藜芦醇处理组的RSV滴度明显低于单纯RSV组,相应细胞的地塞米松处理组的RSV滴度无明显变化,而利巴韦林组的RSV滴度明显低于单纯RSV组。RSV感染9HTEo细胞后,白藜芦醇组和地塞米松组的IL-6水平明显降低,但IL-8无明显变化,利巴韦林组的IL-8和IL-6水平明显降低;RSV感染9HTEo细胞后再给与胞内PolyIC刺激后,白藜芦醇组,地塞米松组的IL-8和IL-6水平均明显降低,而利巴韦林组IL-8和IL-6无明显变化。RSV感染9HTEo细胞后,白藜芦醇处理组的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达明显降低,TLR3蛋白无明显变化;地塞米松组和利巴韦林组的TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表达均明显降低。结论:白藜芦醇可抑制RSV在气道上皮细胞中的复制和抑制dsRNA-TLR3通路的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达,从而抑制RSV诱导上皮细胞分泌的IL-6,提示白藜芦醇抑制RSV感染后气道炎症反应的作用。