研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病患者中最常见且危害最大的合并症之一。众多的DN患者最终出现慢性肾功能不全,使得糖尿病成为目前全球终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)中最重要的原发病。DN的病理和病理生理发展是一个缓慢且复杂的过程,但是目前有众多的实验研究证据支持过度的细胞凋亡是其中重要的发生机制。细胞凋亡是指在一定生理或病理条件下机体为维护内环境的稳定,通过有序的基因调控而诱导的细胞自杀。细胞凋亡和细胞增生共同调节各部分细胞总量的平衡。糖尿病状态下,促使细胞凋亡的诱导因素大大增多,使得凋亡的强度大于细胞增生,导致组织细胞数量减少,器官功能减退。目前认为有三条通路参与凋亡的发生：线粒体通路,死亡受体通路和内质网通路。内质网通路是新近研究发现的凋亡途径,其核心内容是内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)反应。内质网在细胞中具有重要的功能,主要是参与膜／分泌性蛋白、氨基多糖、磷脂、胆固醇及钙信号等的代谢,特别是分泌性蛋白的合成与空间折叠、蛋白质糖基化修饰、蛋白质分泌等。当细胞内外的因素打破了蛋白质合成、成熟与降解之间的稳态,造成细胞内异常蛋白堆集,将诱发ERS。ERS通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)来适应细胞内外的应激,维持细胞的存活,主要的细胞反应包括暂时性中断细胞内总体蛋白合成、上调内质网分子伴侣和折叠酶的表达,诱导内质网相关性降解(ER-associated degradation, ERAD)处理蓄积的蛋白分子等,但是如果应激因素持续存在或刺激过强时,细胞功能不能恢复时,内质网相关的细胞凋亡(ER-associated apoptosis)就会激活,受损细胞通过凋亡通路消亡,从而达到维护整体器官功能的目的。但是如果凋亡的范围过大,速度过快,失去正常的调控,将导致组织细胞的大量丧失,同样导致器官功能严重减退。肾脏细胞具有发达的内质网。电镜扫描显示,肾小球的系膜细胞(mesangialcell)、肾小囊的足细胞(podocyte)和肾小管的上皮细胞(tubular epithelial cell)的内质网结构丰富而复杂。从细胞功能上讲,肾脏细胞与蛋白的合成、分泌和降解关系密切：系膜细胞合成基膜和系膜基质成分,吞噬和降解沉积在系膜上的免疫复合物,分泌肾素等生物活性物质；足细胞是肾脏滤过屏障的组成部分,细胞膜外联结有丰富的糖蛋白,其完整性直接影响肾小球的滤过功能；肾小管上皮细胞除了重吸收管腔内的蛋白质并将其代谢掉,还可分泌激肽释放酶等活性分子。肾脏细胞的这些诸多功能很大程度上依赖于内质网来完成。因此,从细胞的结构和功能分析,肾脏具有发生ERS的条件和基础。从ERS激活的刺激因素来讲,糖尿病状态下可能的刺激因素大大增加,包括高血糖,氧化应激,蛋白尿以及细胞内外电解质紊乱等,但目前关于ERS与糖尿病肾损害的具体试验证据尚不充分。因此,阐明糖尿病肾脏损害中ERS相关细胞凋亡的概况,明确触发凋亡的应激因素,了解凋亡通路的过程,从而对细胞凋亡做到适当的干预调节,挽救残存的肾脏细胞,对保护糖尿病患者的肾脏功能具有重要的积极意义。研究目的1.构建糖尿病大鼠模型,验证糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡增加；2.明确内质网应激在糖尿病大鼠肾脏细胞中是否激活；3.明确内质网应激相关凋亡通路在糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡中的信号通路。研究方法1.糖尿病大鼠模型的构建7周左右的雄性Wistar大鼠30只,体重280±10g。随机分为2组：对照组10只,糖尿病组20只。标准大鼠饲料适应性喂养1周后,禁食12h,糖尿病组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)65mg/kg(溶于pH4.5的柠檬酸盐缓冲液),对照组大鼠则注射等量同pH值的柠檬酸盐缓冲液。糖尿病大鼠成模的诊断标准为：STZ注射7天后,尾静脉取血测定空腹血糖≥16.7mmol/L(300mg/d1)。未达此标准者则剔除。糖尿病组大鼠自血糖达到成模标准后,继续喂养16周,处死取材。2.血糖监测和24小时尿白蛋白的测定血糖每4周检测一次,造模后第1周和第16周利用代谢笼收集大鼠24小时尿液,测定尿白蛋白含量。3.肾脏组织病理学检查第16周末动物处死后,进行肾脏组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片,常规苏木素-伊红染色(H&E)和过碘酸雪夫染色(PAS),判断糖尿病大鼠是否出现DN的病理表现。4.TUNEL染色法检测细胞凋亡利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测试剂盒,进行石蜡切片的TUNEL染色,观察并统计细胞凋亡水平。5.免疫组织化学检测取石蜡组织切片,进行GRP78, Caspase-12, p-JNK和CHOP免疫组织化学染色,观察各个指标阳性细胞的分布和强度。6.免疫印迹Western blot检测取-80℃保存肾脏组织,提取总蛋白,经过10%--14%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜、抗体孵育、ECL显色等步骤,检测GRP78、Caspase-12、CHOP、Total-JNK和p-JNK的蛋白表达水平。7.实时定量RT-PCR法检测利用Trizol法提取两组肾脏组织RNA,经逆转录反应得到总cDNA,以β-actin作为参照,通过real-time PCR技术检测GRP78、Caspase-12、CHOP和JNK的mRNA表达水平。研究结果1.实验动物的基本情况对照组大鼠精神状态良好,体重增加明显,反应敏捷,毛色白而光泽。糖尿病组大鼠精神萎靡,体重增加迟缓,出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状,皮毛脏乱无光泽,部分出现烂尾、白内障等。整个实验过程中3只大鼠死亡,均为糖尿病组,死亡原因可能与糖尿病酮症酸中毒、感染或其他相关并发症有关。最终共27只完成实验,其中对照组10只,糖尿病组17只。2.大鼠DN的确定实验组大鼠DN的确定通过血糖和24小时尿白蛋白的测定以及肾脏组织切片病理检查共同确定。糖尿病大鼠组血糖自成模后第一次测量后,一直维持在16.7mmol/L以上,与对照组相比,具有显著性差异(P<0.05)。16周末24小时尿蛋白测定,与对照组相比,糖尿病组大鼠明显升高(P<0.05)。病理切片检查示与对照组大鼠肾脏比较,糖尿病大鼠肾小球体积增大,系膜基质增多,肾小管上皮细胞出现空泡变性,小灶样萎缩,小动脉管壁增厚,肾间质纤维化和玻璃样变。因此可判断糖尿病大鼠组出现DN改变。3.糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡增加TUNEL染色检测肾脏细胞凋亡水平,结果示与对照组大鼠相比较,糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡明显增加(P<0.05),凋亡细胞在肾小球和肾小管中均可观察到。4.糖尿病肾脏中内质网分子伴侣GRP78表达上调GRP78是位于内质网中重要的分子伴侣,帮助蛋白质的折叠和成熟,是广泛使用的ERS激活的标志分子。免疫组织化学、免疫印迹法和实时定量PCR法检测GRP78在两组肾脏组织中的分布范围和表达水平。结果显示,正常肾脏组织中,GRP78在肾小管细段和远曲肾小管上皮细胞中有轻度表达,而在糖尿病肾脏中,GRP78在肾小球和近端肾小管表达升高,在肾小管细段以及远端肾小管的表达则有显著的升高(P<0.05)。蛋白水平和mRNA水平的检测结果与免疫组化结果相一致,GRP78在糖尿病肾脏中表达明显上调(P<0.05)。ERS在糖尿病肾损害中激活。5.内质网相关凋亡通路的检测CHOP, JNK和Caspase-12分别是三条内质网相关凋亡通路中的关键分子。三条通路相对独立,任一通路的激活均可导致细胞的凋亡。Western blot检测结果示与对照组相比,糖尿病组CHOP, p-JNK和Caspase-12的表达水平均明显升高(P<0.05)。mRNA水平检测,糖尿病组JNK mRNA水平与对照组比较无显著性差异(P>0.05),CHOP, Caspase-12 mRNA表达水平则明显升高(P<0.05)。免疫组化结果显示,与对照组相比,在糖尿病大鼠肾脏中,三个分子的分布范围和表达强度明显升高,但三个分子之间相比,分布范围存在显著差异。Caspase-12在对照组肾脏组织中不能检测到,在糖尿病肾脏中,阳性细胞主要分布在肾小球中；p-JNK的分布主要是肾小球和肾小管区间质中,尤其是间质的小血管中,呈强阳性表达；CHOP的分布则主要是远曲小管上皮细胞中,在肾小球和近端小管中也可检测到颗粒样阳性表达。因此,3条内质网相关凋亡通路都可能参与DN的病理发生,但具体的激活途径和应激细胞存在差异。结论1.STZ诱导的糖尿病大鼠16周,出现DN的表现,肾脏细胞凋亡增加；2.糖尿病大鼠肾脏GRP78的表达显著上调,ERS在糖尿病大鼠肾损害中激活；3. CHOP, JNK和Caspase-12介导的3条内质网相关凋亡通路在DN中都激活,但各自激活的方式和存在的细胞可能存在差异。研究背景肾小球硬化是糖尿病肾病DN最重要的特征性病理改变,其主要形成原因是肾小球系膜区系膜细胞增生和系膜基质的大量增加。但是到了DN的中晚期,硬化的肾小球内过多的系膜基质仍在,但系膜细胞的数量却呈耗竭状态。系膜细胞从过度增生到异常减少的过程中,过度的细胞凋亡被认为是肾小球系膜细胞缺失的重要机制。实验证据证明,在DN的发生发展过程中,伴随着肾小球内血管紧张素Ⅱ(angiotensin II, ANGⅡ)的高水平表达。无论是在生理还是病理状态下,ANGⅡ与肾脏系膜细胞都具有密切的关系。肾脏系膜细胞是肾小球主要的组成细胞之一,位于毛细血管球之间,不仅对血管球起到支持和连接的作用,而且是系膜基质的主要来源细胞,通过其收缩功能调节肾小球的滤过面积,可分泌多种细胞因子等,尤其是病理损害状态下。系膜细胞表面不仅有ANGⅡ的受体ATl,而且系膜细胞还可促进ANGⅡ的裂解生成。ANGⅡ与细胞表面的受体结合,从而产生收缩细胞,促进细胞外基质合成和分泌细胞因子等效应。除此以外,ANGⅡ还有导致细胞损伤,诱导细胞凋亡的效应。超微结构研究显示,肾脏系膜细胞具有发达的内质网系统。内质网是蛋白质翻译后加工的场所,尤其是蛋白质的糖基化修饰,分泌蛋白的空间折叠等,而系膜细胞的重要产物是细胞外基质,其成分主要是糖蛋白和蛋白多糖。系膜细胞的蛋白合成十分活跃,尤其是在肾小球硬化发展过程中,系膜基质处于过度增多状态。而各种原因造成内质网内未折叠蛋白蓄积,将诱发内质网应激(ERS)。适度的刺激,内质网通过暂时性中断细胞内蛋白合成、上调内质网分子伴侣和折叠酶的表达,诱导内质网相关性降解(ERAD)处理蓄积的蛋白等措施维持细胞存活,而持续或过度强烈的刺激,将导致内质网相关凋亡通路的激活,诱导细胞凋亡。近年来研究发现,ANGⅡ是多种细胞凋亡的诱发因素,其发生机制可能与ERS相关。但目前ANGⅡ诱导肾脏系膜细胞凋亡的ERS通路还缺乏明确的试验证据。体外实验证据证明,ANGⅡ可诱导系膜细胞活性氧自由基(ROS)的产生。而氧化应激可导致ERS发生的试验证据已经比较充足,因此ANGⅡ可能通过氧化应激激活ERS凋亡通路诱导系膜细胞凋亡的发生。除此以外,ANGⅡ的促进蛋白合成效应如果造成未折叠蛋白在内质网中的过度蓄积,也将诱发ERS。因此,本试验将进行ANGⅡ的系膜细胞体外诱导凋亡试验,验证ERS凋亡通路是否参与其中,从而为肾脏细胞的保护提供新的治疗靶点。研究目的1.观察ANGⅡ是否激活系膜细胞的ERS。2.明确ERS相关凋亡通路是否参与ANGⅡ诱导的系膜细胞凋亡。研究方法1.实验设计1)体外培养大鼠肾脏系膜细胞系HBZY-1,分别给与ANGⅡ不同浓度(0,1,10,100 nM)和不同时间梯度(0,12,24,48小时)刺激,利用Annexin V/PI试剂盒,在流式细胞仪上检测细胞凋亡率,筛选出ANGⅡ最佳刺激浓度和时间；2)给予系膜细胞最佳刺激浓度和时间ANGⅡ处理,检测ERS标志蛋白GRP78和ERS凋亡相关分子CHOP, Caspase-12和p-JNK的表达；3)根据步骤2的结果,对凋亡过程中表达上调的ERS凋亡分子,给予相对应的siRNA预处理,然后进行ANGⅡ最佳刺激浓度和时间处理,检测细胞凋亡率的变化。2.系膜细胞系的体外培养大鼠肾脏系膜细胞系HBZY-1购自中国武汉细胞库,在低糖DMEM培养基(葡萄糖浓度5.5mmol／L)中培养,取代数在10-20,处于生长对数期的细胞进行试验。3.细胞免疫荧光染色将系膜细胞种植在放有玻片的6孔板中,制作细胞爬片。待细胞生长至70%融合状态,给予ANGⅡ最佳浓度和时间刺激。刺激完毕后,取出爬片,清洗,固定,封闭,GRP78一抗孵育,FITC标记的二抗反应后,DAPⅠ染核,荧光显微镜下观察ERS标记分子GRP78的表达。4. Annexin V/PI试剂盒检测细胞凋亡率细胞刺激完毕,胰酶消化细胞,制作适当浓度细胞悬液,分别加入Annexin V-FITC和PI进行标记反应,随即进行流式细胞仪的检测。5. Western blot检测蛋白质的表达变化细胞刺激完毕,细胞刮刀收集细胞,提取总蛋白,进行SDS-PAGE电泳分离,转膜,蛋白印迹和免疫反应后检测GRP78, CHOP, Caspase-12和p-JNK的蛋白表达水平。6.实时定量RT-PCR法检测mRNA表达水平利用Trizol法提取刺激细胞总RNA,以β-actin作为参照,通过real-timeRT-PCR技术检测GRP78、Caspase-12、CHOP和JNK的mRNA表达水平。研究结果1.ANGⅡ呈浓度和时间梯度依赖性诱导系膜细胞的凋亡给予系膜细胞不同浓度(0,1,10,100 nM)ANGⅡ刺激24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示,细胞凋亡率呈逐渐上升趋势,分别为1.37%±0.41%,3.72%±1.23%,9.27%±3.53%,17.74%±5.19%(P<0.05)。而使用100nM的ANGⅡ给予系膜细胞不同时间段(0,12,24,48小时)的刺激,细胞凋亡率的结果分别为1.53%±0.49%,5.72%±1.97%,19.14%±6.53%,24.74%±9.19%(P<0.05)。但是在48小时组,细胞坏死率明显上升,与24小时组相比,细胞坏死率为4.53%±1.69%VS.15.76%±6.87%(P<0.05)。因此可知ANGⅡ呈浓度和时间梯度依赖性诱导系膜细胞的凋亡。在本试验中,最佳的ANGⅡ浓度为100nM,而最佳的刺激时间为24小时。2.ANGⅡ上调ERS标志分子GRP78的表达细胞免疫荧光染色,Western blot和Realtime PCR三种方法检测100nmol／LANGⅡ刺激24小时后,系膜细胞内GRP78的表达。结果示与空白刺激组相比,GRP78的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。3. CHOP和Caspase-12在ANGⅡ的ERS凋亡诱导中表达上调ANGⅡ100 nmol/L刺激系膜细胞24小时后,收集细胞,Western blot和Realtime PCR分别检测ERS相关凋亡分子的表达变化,结果示：与对照组相比,CHOP和Caspase-12的蛋白质和mRNA表达水平显著增加(P<0.05),而p-JNK的表达无显著性差异(P>0.05)。提示ANGⅡ的ERS凋亡诱导可能通过CHOP和Caspase-12介导。4. CHOP和Caspase-12 siRNA转染降低ANGⅡ诱导的系膜细胞凋亡率系膜细胞生长至30-50%融合状态,分别转染CHOP和Caspase-12 siRNA。转染后24小时,再给以ANGⅡ100 nmol／L24小时刺激,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果示与ANGⅡ+对照转染组相比,CHOP和Caspase-12 siRNA组均可显著降低细胞凋亡率,对照转染组,CHOPsiRNA组和Caspase-12 siRNA组的凋亡率分别为31.74%±8.57%,20.61%±6.33%,18.94%±5.49%(P<0.05)。结论1. ANGⅡ可诱导肾脏系膜细胞ERS的激活；2. ANGⅡ可通过CHOP和Caspase-12通路介导诱导系膜细胞的ERS凋亡效应。