研究背景宫颈癌是威胁全世界女性健康最为严重的疾病之一,其发病率和死亡率均居女性生殖道恶性肿瘤的首位。目前研究已经证实,高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papillomavirus, HR-HPV)的持续感染是宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及宫颈癌发生的必要条件。当阴道感染HPV病毒后,大多数女性的阴道微环境可以自行将病毒清除。只有少数女性的HPV病毒可以长时间存在于阴道微环境中,经过5-10年的时间,最终发展为CIN及癌变。因此,在这个过程中可能还有其它致癌因素或协同HPV作用的因素存在,导致宫颈感染HPV的易感性增加,HPV感染得以持续存在,最终导致癌变发生。阴道菌群作为维护阴道微环境稳定的重要因素,其在HR-HPV持续感染过程中是否扮演一定作用一直被人们所关注,不同研究的结果也不尽相同。阴道微生物研究的关键在于阴道菌群的鉴定,早期的研究主要建立在传统培养技术的基础上。女性的生殖道是一个相对密闭的环境,阴道微生物以厌氧菌为主,培养条件和营养需求要求严苛,导致目前很大一部分细菌仍然无法分离培养及鉴定,因此使用传统的培养依赖方法难以全面的认识阴道微生物的群落结构。近年来,随着非培养依赖的分子生物学技术的发展与进步,如荧光原位杂交、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等,使人们对阴道菌群的认识取得了突破性进展。但是这些较传统的分子生物学技术仍然具有其局限性,不仅研究工作量大、所需时间长,且不能完整的反映整个微环境中细菌群落的结构信息,甚至存在重要信息缺失的可能。Barcoded Paired-End Illumina Sequencing (BIPES)法是基于Illumina Solexa高通量测序平台,结合16S rRNA标签序列分析微生物群落的新一代测序方法,具有操作简单、成本低廉、重现性好等诸多优点,能简便、快捷的获得系统的、结构化的、全面的菌群信息。本研究利用这一新的测序方法,对HR-HPV感染女性和健康女性的阴道菌群进行检测,更加准确及全面的认识HR-HPV感染女性与健康女性阴道菌群物种多样性和群落结构,探讨HR-HPV感染与阴道菌群之间的关系。同时,通过对不同级别宫颈病变女性的阴道菌群进行分析,了解不同级别宫颈病变女性阴道微生物的分布特征、群落结构及宫颈病变发生发展中各微生物种群的动态变化,以期为进一步研究宫颈病变的病因、发生发展过程中阴道微生态疗法及益生菌制剂的开发提供理论基础。研究目的1.借助Illumina高通量测序平台及BIPES的序列研究方法,分析HR-HPV感染女性和健康女性阴道微生物的菌群构成及其多样性,比较HR-HPV感染女性和健康女性阴道菌群的差异,探索HR-HPV感染与阴道菌群的关系。2.通过对不同级别宫颈病变女性的阴道菌群进行分析,了解宫颈病变不同阶段的阴道微生物分布特征及群落结构,追踪宫颈病变发生发展过程中各微生物种群的动态变化,探寻阴道菌群的动态变化与宫颈病变发生发展的关系。研究方法第一章：1.研究对象选取2014年9月至2015年9月间于南方医科大学珠江医院妇产科健康体检或诊治的女性,根据HR-HPV筛查(hC2法)结果分为2组：①HPV阴性组(HPV-组)33例：均为健康体检者,HR-HPV检查均阴性；②HPV阳性组(HPV+组)98例：HR-HPV均阳性。纳入标准：年龄21-65岁；有性生活史3年及以上；非月经期、妊娠期及产褥期妇女。排除标准：年龄>65岁；无性生活史者；合并免疫缺陷疾病者；合并全身系统性疾病者：糖尿病、激素治疗性疾病(急慢性肾炎等)等。同时需满足以下条件：48 h内无阴道冲洗；3d内无性生活史、阴道放药史；1个月内未系统性使用抗生素或抗真菌药。2.标本采集：以无菌棉拭子于阴道穹窿或阴道中段侧壁处留取分泌物,用于16S rRNA基因提取。3.总DNA提取：采用阴道拭子基因组DNA试剂盒提取样本总DNA,具体步骤参考说明书。DNA提取后置于-20℃冰箱保存。4.16S rRNA-V4区的PCR扩增及Illumina测序：以提取的DNA为模板,扩增其16S rRNA V4区的基因片段。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及紫外荧光定量后,以相等的终浓度将PCR产物混合均匀,送至深圳华大基因进行双末端100bp测序,测序平台为Illumina HiSeq2000。5.对原始测序数据以BIPES程序进行预处理。通过两阶段聚类(Two-stage-clustering, TSC)的分析方法提取出每个操作分类单元(operational taxonomy units, OTU)的代表序列,然后再利用GAST对OTU进行归类,用于样品间的相似性分析,主要包括Alpha多样性、Beta多样性及菌群结构分析。通过linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements (LEfSe)在线分析工具分析两组间阴道菌群群落结构及菌属差异。6.统计学处理：应用SPSS19.0软件进行统计分析,两组计量资料间的比较采用两独立样品的t检验,对多样性指数应用Mann-Whitney U检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。第二章1.研究对象选取2014年9月至2015年9月间于南方医科大学珠江医院妇产科健康体检或诊治的女性,根据宫颈液基细胞学、HR-HPV筛查(hC2法)和宫颈活检病理结果分为4组：①正常组(N组)33例：均为健康体检者,宫颈细胞学及HR-HPV检查均阴性；②低级别组(L组)26例：HR-HPV检查阳性；和／或宫颈活组织检查确诊为低级别宫颈上皮内瘤变；③高级别组(H组)40例：HR-HPV检查阳性,宫颈活组织检查确诊为高级别宫颈上皮内瘤变；④宫颈癌组(C组)32例：HR-HPV检查阳性,宫颈活组织检查确诊为宫颈癌。纳入标准与排除标准与“第一章”相同。标本采集、总DNA提取、PCR扩增、PCR产物测序和数据处理与“第一章”相同。统计学处理时多组间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、LSD两两检验,余与“第一章”相同。研究结果实验一1.本实验测序样品数131个,共获得971007条序列,平均每个样品7412条。2.采用PD_whole_tree (PD)和Shannon两个多样性指数来比较HPV-组和HPV+组阴道菌群Alpha多样性的差异。结果显示HPV+组的PD指数和Shannon指数均增高,且两组间Shannon指数的差异具有统计学意义(P=0.000)。3.在菌属水平上,HPV-组以乳酸杆菌为优势菌属,占81.54%。HPV+组的菌群结构呈多样性改变,乳酸杆菌属含量显著下降,仅占40.48%,同时加德纳菌属相对丰度显著增加,由3.01%增加至19.87%。普氏菌属、奇异菌属、消化链球菌属等多种厌氧菌属和脲原体属、支原体属相对丰度也增加。4.利用QIIME软件进行两组间的Beta多样性分析显示,两组阴道微生物的总体菌群结构在Weighted_unifrac距离的聚类结果可显著的区分为2个不同的部分。5.通过LEfSe分析两组间差异菌属发现,乳酸杆菌属在HPV-组中富集,而加德纳菌属、普氏菌属、奇异菌属、厌氧球菌属、拟杆菌属、不动杆菌属等厌氧菌属在阳性组中富集,且于HPV+组中检测到布鲁氏菌属的存在。实验二1.本实验测序样品数131个,共获得971007条序列,平均每个样品7412条。2.采用PD_whole_tree (PD)和Shannon两个多样性指数对四组阴道菌群的Alpha多样性进行分析。随着宫颈病变的发生发展,阴道微生物的Alpha多样性逐渐增加,菌群的群落结构发生显著变化,且于宫颈癌组患者中阴道微生态改变达最大化。3.在属水平上,随着宫颈病变的发生发展,乳酸杆菌属相对丰度逐渐下降；加德纳菌属的比例先骤增而后逐渐降低；大量低丰度、未知菌属的含量逐渐增加；多种厌氧菌属所占比例也有不同程度的增加。4.通过LEfSe进行各组间差异菌属分析发现,加德纳菌属、支原体属、脲原体属主要在低级别组富集,高级别组和宫颈癌组主要富集多种厌氧菌属。5.四组阴道菌群的总体结构在Weighted_unifrac距离的聚类结果有差异。随着宫颈病变的发生发展,与正常组的距离逐渐拉开,直至显著的区分为2个不同的部分。相邻两组间的阴道微生物存在某些相似的菌群构成,但同时具有相互分开的趋势。研究结论1.健康女性的阴道菌群结构相对单一,HR-HPV感染女性阴道菌群多样性增加,提示阴道菌群失调与HR-HPV感染之间存在相关性。2.随着宫颈病变的发生发展,阴道菌群结构呈现乳酸杆菌属逐渐减少,物种多样性逐渐增加的趋势。3.阴道菌群中乳酸杆菌属的减少和／或布鲁氏菌属的出现可能是导致HR-HPV持续存在并致瘤的原因。