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肠病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原之一,主要感染婴幼儿及儿童,可导致手足口病、并可能诱发脑炎等多种严重症状,致残率和病死率均较高。研究表明EV71主要通过粪-口途径进入口腔咽部并在咽部启动病毒复制。咽部上皮细胞是EV71感染、复制的初始靶细胞。而病毒特异性IgA是粘膜上皮细胞抵御病原感染的重要因子,其可与上皮细胞pIgR结合而被转运入胞,从而发挥胞内中和的作用,降低病毒复制。3D蛋白作为EV71病毒的RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中具有重要作用。据此,本实验室前期对EV71病毒3D蛋白进行了系列单克隆抗体的制备和筛选并获得了一株具有高效抑制EV71复制的鼠源单克隆IgA抗体--3A12-IgA。本研究采用人鼠嵌合抗体的策略对3A12-IgA进行了人源化重组改造,并探索了重组IgA抗体的真核表达及制备。第一,分别构建了人源化IgA抗体(RH3A12-IgA)的真核表达质粒系列,包括:重组IgA重链的真核表达质粒VH-pFUSEss-CHIg-h A1、重组IgA轻链的真核表达质粒VL-p FUSE2ss-CLIg-hk、以及人J链基因真核表达质粒IgJ-pcDNA3.1(+)。第二,通过三质粒(VH-p FUSEss-CHIg-hA1、VL-pFUSE2ss-CLIg-hk、IgJ-pcDNA3.1(+))共转染CHO-K1细胞等技术建立了ELISA、Western Blot等方法,并对表达的重组抗体进行了表达量、生化功能等检测。第三,从重链和轻链的信号肽、三质粒的转染比例、表达细胞系的选择以及Kozark序列的添加等方面进行了人源化重组IgA抗体RH3A12-IgA的表达体系优化,确定了表达体系参数,达到4.4μg/ml分泌型表达量。第四,采用293T细胞进行了重组抗体RH3A12-IgA的批量表达,以及Kappa-select亲和层析纯化。通过Transwell系统对纯化的重组抗体进行了生物学活性检测,结果表明重组抗体可被Vero-pIgR细胞有效转运,并具有一定的中和作用。综上所述,本研究构建了人源化抗体RH3A12-IgA的重链、轻链及J链的真核表达质粒、及其293T细胞表达体系。有效制备了纯化的人源化重组抗体RH3A12-IgA,证明了重组抗体的生物学活性。研究结果为鼠源IgA单克隆抗体的人源化改造和表达制备奠定了实验技术基础,具有重要的潜在应用意义。