新生血管生成是发生在胚胎时期和出生后的基本、普遍的生理过程，但是也是许多疾病如肿瘤、慢性炎症和眼部血管增殖性疾病的重要病理表现。近年来，由于抑制新生血管生成可望成为治疗肿瘤的有效策略，使得对新生血管生成和增殖的研究取得巨大发展。而除了肿瘤防治外，抑制新生血管的生成也为血管增殖性视网膜病变(如糖尿病视网膜病变、新生儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞等)的防治带来新的研究思路和方向。 血管增殖性视网膜病变是一类常见的致盲性眼病，许多疾病如糖尿病视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞和早产儿视网膜病变等都可以引起血管增殖性的视网膜病变。该类疾病最终因视网膜新生血管增殖、出血和牵拉性视网膜脱离而导致的不可逆的失明。血管增生性视网膜病变是以视网膜新生血管生成和纤维增殖为主要特征的致盲性眼病，且发病确切机制不甚明了。目前研究结果认为，病理性的血管增殖是由于血管生成的促进和抑制因素之间失衡。其中VEGF是促血管生成中的关键因子。目前针对血管增生性视网膜病变的主要治疗方法是激光和手术治疗，但效果欠佳。 中药川芎嗪具有扩张小动脉、改善微循环障碍、清除氧自由基、抗脂质氧化等药理作用，临床上已广泛用于心脑血管性疾病和抗缺血再灌注损伤的治疗。近年来一系列研究表明川芎嗪可抑制VEGF的表达，有临床观察提出川芎嗪可提高视网膜中央静脉阻塞和糖尿病视网膜病变患者视力、减轻视网膜黄斑水肿，减缓病变发展。因此我们设想通过研究川芎嗪对体内外新生血管生成的影响，以及探讨川芎嗪对氧诱导的小鼠视网膜血管增殖的抑制作用及其可能机制，探索一种有效、实用的治疗视网膜血管增殖性病变的药物，此亦可惠及其他新生血管性疾病。 第一部分川芎嗪抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的作用研究 目的：观察川芎嗪对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的抑制作用。 方法：将48只种蛋随机分成4组，孵化条件为37.8±0.5℃，湿度保持在55％左右。孵育至第8天，在蛋壳上开一小窗，暴露绒毛尿囊膜，保持鸡胚活力及卵黄膜的完整性。第9天将生理盐水(组1)或不同剂量的川芎嗪与1％羟丙基甲基纤维素制成混合物(组2，2.5ug/ul；组3，5.0ug/ul；组4，10ug/ul)备用。将甲泼尼龙琥珀酸钠预处理的滤膜环(外环O7mm，内环O5mm)小心置于绒毛尿囊膜上相对无血管区，然后将备好的混合物局部敷加在环内，用微量进样器向滤膜环内覆加各混合物10ul，即组1：NS(对照组)；组2，25ug/环；组3，50ug/环；组4，100ug/环。封上窗口继续孵育。至第12天，将绒毛尿囊膜和滤膜环共同固定、收获，并照相记录。通过计数滤膜环内平均血管分叉数来评价血管密度。 结果：在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，各组平均血管分叉数为148.7±38.0(组1，NS)，156.6±41.9(组2，川芎嗪25ug/环)，99.6±34.6(组3，川芎嗪50ug/环)，110.6±55.3(组4，川芎嗪100ug/环)。与对照组平均血管密度相比，组4下降了25.6％(P=0.047＜0.05)，组3下降了33.0％(P=0.012＜0.05)。组2比组1略高5.3％(P=0.687)，无显著性差别。组3、4之间也无差别(P=0.539)。 结论：川芎嗪部分抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成。 第二部分川芎嗪抑制氧诱导的小鼠视网膜血管增殖及其机制研究 目的：运用CD31免疫荧光标记法，观察川芎嗪腹腔注射对氧诱导小鼠视网膜血管增殖的影响，并探讨其可能机制。 方法：建立氧诱导的小鼠视网膜血管增殖模型。将40只C57BL/6J OIR模型小鼠随机分为四组，在P12-P16，每天一次给小鼠腹腔注射100mg/kg(第2组)、200mg/Kg(第3组)、400mg/Kg(第4组)的盐酸川芎嗪注射液，以腹腔注射0.05ml生理盐水作对照组(第1组)。至P17，免疫荧光法特异性标记视网膜CD31抗原，铺片，定量计算视网膜新生血管的面积。另外将12只小鼠随机平分为两组，造OIR模型，P12-P14分别注射生理盐水和400mg/Kg盐酸川芎嗪，于P12，P13，P14分次提取小鼠视网膜总RNA，用RT—PCR法检测各时间VEGF及HIF-1amRNA的表达。 结果：视网膜铺片检测视网膜新生血管面积：对照组2.26±0.94 m㎡，高剂量组(川芎嗪400mg/kg)为1.42±0.48 m㎡，中剂量组(川芎嗪200mg/kg)为1.70±0.61 m㎡，低剂量组(川芎嗪100mg/kg)为2.19±1.03 m㎡。与对照组相比，高剂量组OIR小鼠视网膜新生血管面积下降了37.0％(P=0.001)；中剂量组下降了24.8％(P=0.03<0.05)；低剂量组与对照组无显著性差异。各剂量组的结果存在明显的剂量依赖性。与对照组相比，实验组小鼠视网膜组织在P12、P13、P14，VEGF mRNA表达平均下降了27.9％，13.8％，27.2％，HIF-1a mRNA表达27.5％，26.9％，43.4％。此外，免疫荧光特异性CD31抗原标记法，可清晰显示新生血管。 结论：腹腔注射川芎嗪可抑制氧诱导的小鼠视网膜新生血管增殖，抑制效应具有剂量依赖性。其抑制作用可能通过下调视网膜组织HIF-1a及其下游VEGF mRNA的表达来实现。 第三部分川芎嗪对人视网膜血管内皮细胞二维血管结构的影响 目的：观察川芎嗪对体外培养的人视网膜微血管内皮细胞二维血管样结构形成的影响。 方法：用本课题组已建立的方法分离、培养、鉴定人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)。将基质胶(9.5mg/ml)以50ul/孔的量包被12孔板，37℃孵育30min。包被后向每孔中加入HRCECs约1×105/孔。将细胞分成4组，分别用无血清内皮培养基+生理盐水(组1)和无血清培养基+川芎嗪(组2，100ug/ml；组3，200ug/ml；组4，400ug/ml)处理各组。1，2，4，6，8，10，16，24小时后，照相记录细胞变化情况。 结果：将HRCEC种植于用基质胶包被的12孔板内，1h后细胞黏附在基质胶上；随后，细胞形态发生变化，逐渐延长形成双极样细胞；细胞轴向延长、移行，形成相互吻合的细胞束(2-4h)；8-12h，最终形成二维血管样网状结构；16-48h，细胞束继续拉升、变细，最后逐渐崩裂、塌陷并脱离培养皿。以上观察到的结果在组2，3，4受到抑制和延迟，尤其以组4最为明显。与对照组相比，经川芎嗪处理12h后，各组无显著性差异；24h后，高剂量组血管环平均面积为对照组的37.6％(P<0.001)，中剂量组为对照组的47.6％(P<0.001)，低剂量组为对照组的64.5％(P=0.005)。就残留血管环平均数量而言，高剂量组残留血管为对照组的2.9倍(P<0.001)，中剂量组为2.2倍(P=P<0.001)，低剂量组为1.75倍(P=0.001)。 结论：川芎嗪明显抑制和延迟了二维血管样结构的扩张和由此引起的管样结构崩解，维持了正常二维血管结构的稳定性，抑制效应和维持二维血管环稳定的作用呈明显剂量依赖性。