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第一部分大鼠孕期维生素A缺乏损伤仔鼠肠神经系统的发育和胃肠运动目的:研究孕期母体维生素A缺乏(VAD)对仔鼠肠神经系统发育及胃肠运动功能的影响,并探讨其可能涉及的信号通路。方法:选取3周龄SD雌鼠,分别构建VA正常(VAN,>1.05μmol/L)、VA缺乏(VAD,<0.7μmol/L)以及孕早期VA补充(VAS,孕鼠E3.5d开始灌胃补充VA一周)动物模型;高效液相色谱法(HPLC)检测血清VA水平;免疫荧光染色观察三组仔鼠E12.5d和E14.5d胚肠中肠神经元TUJ1迁移情况;Western blot方法检测三组仔鼠E14.5d胎肠中视黄酸核受体(RARs)、肠神经元(PGP9.5)、肠胶质细胞(S100β)及肠神经系统(enteric nervous system,ENS)发育过程中关键基因SOX10和Ret的蛋白表达水平;待三组仔鼠成长至8w龄时,观察大便性状,检测大便含水量、总的胃肠传输时间和结肠蠕动力以评估胃肠功能;同时,还用Western blot检结肠组织中胆碱能(ChAT)和氮能(nNOS)肠神经元表达情况;分离结肠肌间神经丛,免疫荧光染色ChAT~+和nNOS~+肠神经元,观察结肠肌间神经丛中胆碱能和氮能神经元分布情况。结果:(1)胚胎期免疫荧光染色结果显示在E12.5d和E14.5d,VAD组早期肠神经元TUJ1在胎肠中的迁移速度慢于VAN组,而VAS组较VAD组增快,与VAN组相比无明显差异,说明孕期母体VA水平影响仔鼠胎肠中TUJ1的迁移速度。(2)三组仔鼠胎肠中RARs蛋白表达水平检测结果显示,RARγ表达水平在三组之间没有差异(P>0.05),然而VAD组的RARα和RARβ蛋白表达水平较VAN组降低(P<0.05),VAS组较VAD组增高(P<0.05),提示母孕期VA水平影响仔鼠胎肠中RARα和RARβ表达水平。(3)VAD组仔鼠胎肠中肠神经元(PGP9.5)和胶质细胞(S100β)较VAN组显著减少(P<0.05),而且SOX10和Ret基因的蛋白表达水平亦较VAN组明显降低(P<0.05),值得注意的是VAS组中PGP9.5、S100β、SOX10和Ret表达水平较VAD组明显增高(P<0.05),且与VAN组没有差异(P>0.05),表明孕期VA水平影响仔鼠胎肠中PGP9.5、S100β、SOX10和Ret的蛋白表达水平。(4)对三组8w龄仔鼠的胃肠功能进行评估,结果显示,VAD组仔鼠肠管轻度胀气,大便呈稀糊状,与VAN组相比,VAD组仔鼠的大便含水量增多(P<0.001)、总的胃肠传输时间延长(P<0.01)、结肠蠕动减慢(P<0.001),而VAS较VAD组大便含水量降低(P<0.001)、总的胃肠传输时间缩短(P<0.01)、结肠蠕动增快(P<0.001),VAN与VAS组之间的差异没有统计学意义(P>0.05),说明孕期VA水平影响成年仔鼠的胃肠功能,尤其是运动功能。(5)对三组8w龄仔鼠结肠中胆碱能(ChAT)和氮能(nNOS)神经元进行评估,结果发现,VAD组结肠中ChAT和nNOS蛋白表达水平明显低于VAN组(P<0.05),而VAS较VAD组增多(P<0.05),VAS与VAN组之间无明显差异(P>0.05);结肠肌间神经丛免疫荧光染色结果显示VAD组ChAT~+和nNOS~+肠神经元较VAN组明显减少(P<0.05),VAS较VAD组增多(P<0.05),VAN与VAS组的差异无统计学意义(P>0.05),说明孕期VA水平影响仔鼠结肠中胆碱能和氮能神经元的数量。结论:母孕期VAD减慢仔鼠胚胎期肠神经元的迁移速度,减少结肠中胆碱能和氮能神经元的数量,损伤仔鼠成年后的胃肠运动功能;孕早期VA补充能逆转孕期VAD对仔鼠ENS发育造成的不良影响。第二部分视黄酸通过RARβ影响肠神经干祖细胞增殖及亚型肠神经元分化目的:探讨VA的活性代谢产物视黄酸(RA)对肠神经干祖细胞增殖和亚型肠神经元分化的影响及其可能涉及的分子机制。方法:用机械分离法联合酶消化法从E14.5d仔鼠胎肠中分离并培养原代肠神经球,用免疫荧光染色鉴定肠神经球。体外不同浓度RA(0μmol/L,0.5μmol/L、1μmol/L、2.0μmol/L、4μmol/L)处理肠神经球,分别增殖培养3天和分化培养7天,Real time-PCR和Western Blot分别检测细胞中RARs、SOX10、P75NGF、Nestin、Ch AT、n NOS的表达水平;免疫荧光染色检测增殖培养条件下P75NGF和Nestin的表达水平以及分化培养后细胞中Ch AT+和n NOS+肠神经元分化情况,探讨RA对肠神经球中干祖细胞增殖及胆碱能和氮能神经元分化的影响。重组si-RARβ和Ad-RARβ腺病毒分别感染肠神经球,Real-time PCR和Western blot方法分析细胞中RARβ、SOX10、P75NGF、Nestin、Ch AT和n NOS表达变化,探讨RARβ表达改变对肠神经球中干祖细胞增殖和亚型肠神经元分化的影响,同时明确RARβ是否影响SOX10的表达。结果:(1)从E14.5d胎鼠肠组织中成功分离和培养出球形小体。(2)免疫荧光双染色结果发现肠神经球同时表达干细胞(Nestin)和祖细胞(P75NGF)、早期肠神经元(TUJ1)和胶质细胞(S100β),证实本实验中获取的球形小体为肠神经球。(3)不同浓度RA(0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2.0μmol/L、4μmol/L)处理肠神经球,增殖培养3天,Real time-PCR检测结果显示,与未处理组(RA 0μmol/L)相比,RA处理后细胞中RARβ和SOX10的m RAN表达水平明显增高(P<0.05),且RA1μmol/L时效果最显著(P<0.001),进一步检测了其蛋白表达水平,结果与m RNA变化趋势一致;但不同浓度RA处理后,与RA 0μmol/L组相比,肠神经球中RARα和RARγ的表达水平差异没有统计学意义(P>0.05),说明在肠神经球中RA促进RARβ和SOX10的表达,但对RARα和RARγ的表达无明显影响;此外,RA处理后,细胞中P75NGF和Nestin的蛋白表达水平较未处理组显著降低(P<0.001),说明RA影响肠神经球中干细胞和祖细胞的数量。分化培养7天,Real-time PCR和Western blot检测结果显示,与RA 0μmol/L组相比,RA处理组细胞中RARβ、SOX10、Ch AT和n NOS表达水平明显增高,且均在RA1μmol/L时效果最显著(P<0.001),进一步说明在肠神经球中,RA可能是通过RARβ信号通路发挥效应。免疫荧光检测结果显示在增殖培养下,RA处理减少了肠神经球中P75NGF和Nestin的表达(P<0.05),而在分化培养时RA处理增加了Ch AT和n NOS神经元的数量(P<0.05),且在RA 1μmol/L时效果最显著(P<0.001),说明体外RA处理,在增殖培养状态下,抑制肠神经干祖细胞的增殖,在分化培养状态下促进胆碱能和氮能神经元分化,且效应与RA浓度有关。(4)重组腺病毒si-RARβ感染神经球后,与空病毒组相比,RARβ的m RNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.001),SOX10的表达也随之下降(P<0.01),Ch AT(P<0.01)和n NOS(P<0.05)的蛋白表达也显著下调,但P75NGF和Nestin的表达却明显增加(P<0.01);当重组腺病毒Ad-RARβ感染肠神经球后,与空病毒组相比,RARβ的m RNA和蛋白水平明显增高(P<0.01),SOX10的表达也随之显著上调(P<0.01),Ch AT和n NOS表达亦增高(P<0.05),但P75NGF和Nestin的表达却明显降低(P<0.01),进一步说明RARβ的表达水平影响肠神经球中SOX10、P75NGF、Nestin、Ch AT和n NOS的表达。结论:RARβ影响SOX10的表达,RA通过RARβ影响肠神经球中干祖细胞增殖及胆碱能和氮能亚型肠神经元分化。