背景:随着社会的进步,生活水平的提高,老龄化的加剧,代谢相关疾病和心血管系统疾病的发病率越来越高,严重威胁人类健康。代谢和心血管系统疾病关系十分密切,而脂肪组织又是代谢过程中关键组织之一。因此,脂肪组织代谢的研究亟待进行,能够让我们更清楚地了解代谢疾病的发生发展具体过程,明确脂肪代谢与心血管疾病的始动关系,从而找到代谢性疾病治疗的更好靶点。脂肪组织是人体储存能量的重要组织,对胰岛素反应敏感,具有较强的摄取葡萄糖的能力;同时,脂肪组织也是人体维持体温的重要组织,特别是棕色脂肪组织,具有特征性非战栗产热能力,对维持体温有十分重要意义。在脂肪组织产热的过程中,伴有脂降解过程,能够显著影响血脂,进而影响心脑血管疾病的进程。因此,脂肪组织的代谢情况可显著影响全身代谢,对多种代谢相关疾病产生影响,如,代谢综合征、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等。人体的脂肪组织分为两种类型:白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)。白色脂肪组织细胞内含有大脂滴,主要功能是储存能量。棕色脂肪组织细胞内含有丰富的线粒体和小脂滴,主要功能是产热以维持体温。除了作为能量仓库的功能之外,白色脂肪组织还能够分泌多种脂肪因子,例如瘦素、脂联素、内脂素、网膜素等等,参与各种代谢的调节。白色脂肪组织主要分布于皮下,肠系膜,腹膜后、附睾等部位。啮齿类动物的棕色脂肪组织主要分布于肩胛间区。以往认为,人类只有在婴儿时期有棕色脂肪组织,成年后消失。直到2009年的研究表明,成年人体内也有棕色脂肪组织,主要分布于颈部两侧、锁骨附近,脊柱周围等位置。据文献报道及我们前期的研究发现,低温刺激可兴奋交感神经,释放儿茶酚胺类激素,通过与脂肪细胞表面的β3肾上腺素能受体结合,激活脂肪细胞内脂滴蛋白和一系列酯酶等,加速脂降解过程。白色脂肪组织在这一过程中,颜色由白转棕,称之为棕色化,这种颜色的变化主要是由于脂肪细胞被激活,线粒体增多引起的。棕色化的白色脂肪组织和棕色脂肪组织能够大量代谢自身或循环中的游离脂肪酸,进行产热,统称为产热脂肪。同时,棕色脂肪和棕色化的白色脂肪对胰岛素极为敏感,能够大量摄取葡萄糖,起到调节代谢的功能。近年研究发现,血脂中低密度脂蛋白胆固醇水平是动脉粥样硬化的高危因素。我们实验室前期研究发现,在ApoE-/-或Ldlr-/-脂代谢异常小鼠中,低温环境能够显著促进皮下白色脂肪脂降解,进而提升血脂中低密度脂蛋白胆固醇水平,促进动脉粥样硬化的发生发展,增加斑块不稳定性。以上结果提示,白色脂肪组织的激活,对代谢和动脉粥样硬化疾病的发生发展有非常大的影响。虽然低温刺激和交感神经兴奋可以激活脂肪组织,但其作用范围太广泛,不适于更深入的机制研究及人体临床研究,故而,更为精准可控制的脂肪组织活化相关研究亟待进行。据文献报道,β3肾上腺素能受体激动剂也可以直接作用于脂肪细胞表面的β3肾上腺素能受体,激活脂肪组织。目前在欧美及日本的临床上用于治疗膀胱刺激征的药物米拉贝隆(Mirabegron),是一种特异性β3肾上腺素能受体激动剂。现有研究表明,正常剂量下,短期应用米拉贝隆对心功能并无显著影响。人体应用4倍临床剂量米拉贝隆的情况下,能够激活棕色脂肪组织。但是长期应用米拉贝隆,其对脂肪组织的长期激活作用,是否会对动脉粥样硬化斑块产生影响,仍未见报道。为此,我们提出以下科学问题:米拉贝隆作为β3肾上腺素能受体激动剂,对脂肪代谢有何影响?又是否对动脉粥样硬化产生影响?研究目的:1.研究米拉贝隆对正常小鼠棕色和白色脂肪组织激活的影响2.研究米拉贝隆对正常小鼠脂肪组织微环境的影响3.研究米拉贝隆对正常小鼠生理及代谢指标的影响4.研究米拉贝隆对ApoE-/-和Ldlr-/-脂代谢异常小鼠生理及代谢指标的影响5.研究米拉贝隆对ApoE-/-和Ldlr-/-脂代谢异常小鼠动脉粥样硬化斑块的作用研究方法:1.实验动物:正常小鼠采用野生型C57/BL6J品系8周龄雄性小鼠,脂代谢异常小鼠采用ApoE和Ldlr基因敲除8周龄雄性小鼠。均饲养于室温。2.实验分组:野生型小鼠随机分为3组,分别是溶剂对照组(vehicle)、米拉贝隆低剂量组(low)和米拉贝隆高剂量组(high)。均为普通饮食。对照溶剂或药物每日灌胃一次,持续4周。ApoE-/-小鼠随机分为3组,分别是溶剂对照组(vehicle)、米拉贝隆低剂量组(low)和米拉贝隆高剂量组(high)。高脂高胆固醇饮食饲养8周,于第三周开始进行对照溶剂或药物灌胃(每日一次),至第8周结束。Lddlr/-小鼠随机分为3组,分别是溶剂对照组(vehicle)、米拉贝隆低剂量组(low)和米拉贝隆高剂量组(high)。高脂高胆固醇饮食饲养8周,于第三周开始进行对照溶剂或药物灌胃(每日一次),至第8周结束。3.检测指标:1)一般测量:平均摄食量、体重、体长、心率、血压等2)PET-CT扫描:小鼠饥饿过夜(8小时),麻醉后,腹腔注射约250μCi的18F-FDG。1小时后,进行PET-CT扫描。3)呼吸代谢率测量:将小鼠用戊巴比妥钠麻醉后,置于呼吸代谢测量仪器中进行相应测量。4)糖耐量检测:小鼠饥饿8小时,腹腔注射葡萄糖,按时间点检测血糖浓度。5)胰岛素耐量检测:小鼠饥饿8小时,腹腔注射胰岛素,按时间点检测血糖浓度。6)组织样本取材:小鼠饥饿过夜,麻醉后取材。留取血清、各处脂肪组织,心脏、主动脉、肝脏等组织。用于组化研究的组织浸泡于4%多聚甲醛中固定。用于分子检测的组织浸泡于液氮中保存。7)血脂水平检测:检测小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸等水平。8)组织学染色和免疫组织化学染色:脂肪组织和血管进行相应组织学染色,主要有HE染色观察组织形态、油红O染色检测脂质含量、天狼星红染色观察胶原水平。免疫组织化学染色,检测脂肪组织内脂滴包被蛋白、线粒体、炎症浸润、血管等水平。9)Westernblot:检测脂肪组织内相应蛋白的表达水平。4.统计学分析:定量数据表示为均数±标准误,两组比较应用双侧t检验,三组及以上应用ANOVA检验。设定p<0.05为有统计学差异。结果:1.米拉贝隆能够显著激活脂肪组织。从对脂肪组织的分析中可以看出,米拉贝隆应用后,脂肪组织体积显著缩小,重量减轻,细胞直径缩小,脂滴减小,拥有更丰富的线粒体,UCP1表达增加,代谢相关信号通路有明显富集。这些证据表明,临床剂量米拉贝隆可以显著激活棕色脂肪组织,高剂量米拉贝隆可以显著激活白色脂肪组织。2.米拉贝隆能够提高小鼠胰岛素敏感性和代谢水平。实验结果显示,米拉贝隆能够提高胰岛素敏感性,提高呼吸代谢率,提示其激活脂肪组织后能够显著提升代谢水平。3.米拉贝隆能够显著促进动脉粥样硬化斑块面积和不稳定性。从对ApoE-/-和Ldlr-/-小鼠主动脉染色等实验结果分析来看,米拉贝隆能够显著增加动脉粥样硬化斑块面积,增加斑块不稳定性和坏死核面积。结论:1.米拉贝隆可以显著激活棕色脂肪组织2.米拉贝隆可以显著促进脂降解,增加ApoE-、-小鼠血中LDL-C水平3.米拉贝隆可以通过激活棕色脂肪组织,显著加重ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变程度意义:第一部分:米拉贝隆是一种β3肾上腺素能受体激动剂,是临床中治疗膀胱刺激征的常用药物。然而,这种药物对非靶向组织和器官的影响尚有许多不明之处。在这项研究中,我们为米拉贝隆可通过激活棕色脂肪,进而加剧动脉粥样硬化的进程,引发心脑血管疾病提供了新的机制见解。鉴于已有文献报道,米拉贝隆可诱导成人受试者棕色脂肪活化,因此我们的研究发现具有极高的临床相关性。此外,Ldlr的基因变异经常发生在人群中(每300人中就有1人携带Ldlr变异)。如果这部分患者接受米拉贝隆治疗,风险将很高。这一重要问题尚未在临床研究中探讨,需要进行进一步研究。背景:代谢综合征对身体健康的影响越来越引起人们的注意。很多疾病都与代谢异常相关,例如高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等。代谢过程中重要的一个方面是能量的代谢。能量主要包括葡萄糖和脂质,而脂肪组织是人体储存能量的重要组织,同时对胰岛素反应敏感,具有较强的摄取葡萄糖的能力。同时,脂肪组织的也是人体维持体温的重要组织。在脂肪组织产热的过程中,伴有脂降解过程,能够显著影响血脂,进而影响心脑血管疾病的进程。因此,脂肪组织的代谢情况可显著影响全身代谢,对多种代谢相关疾病产生影响,如,代谢综合征、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等。据文献报道,低温刺激可兴奋交感神经,释放儿茶酚胺类激素,激活脂肪细胞内一系列酯酶等,加速脂降解过程。脂降解过程可以将甘油三酯降解为脂肪酸及甘油,释放入血,供其他器官利用。其中肝脏可以利用其合成低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白。而血脂中低密度脂蛋白胆固醇水平是动脉粥样硬化的高危因素。我们实验室前期研究发现,在ApoE-/-和Ldlr-/-脂代谢异常小鼠中,4℃低温环境能够显著促进皮下白色脂肪脂降解,进而提升血脂中低密度脂蛋白胆固醇水平,促进动脉粥样硬化的发生和发展,增加斑块不稳定性。在野生型小鼠中,4℃低温仅仅能够激活皮下白色脂肪,-10℃至-20℃低温能够显著激活内脏白色脂肪,进一步提高代谢水平,并增强机体对胰岛素的敏感性。以上结果提示,脂肪组织的激活,对代谢和动脉粥样硬化疾病的发生和发展有非常大的影响。但是,皮下白色脂肪仅仅是白色脂肪的一部分,内脏白色脂肪的激活对动脉粥样硬化病变的作用仍未报道。为此,我们提出以下科学问题:极低温度下,内脏白色脂肪被激活,对于脂代谢异常小鼠动脉粥样硬化斑块是否产生影响?研究目的:1.研究-10℃低温对ApoE-/-脂代谢异常小鼠生理及代谢指标的影响2.研究-10℃低温对ApoE-/-脂代谢异常小鼠动脉粥样硬化斑块的作用研究方法:1.实验动物:脂代谢异常小鼠采用ApoE基因敲除8周龄雄性小鼠。高脂高胆固醇饮食。2.实验分组:ApoE-/-小鼠随机分为3组,分别是30℃组、4℃组和-10℃组。均高脂饮食8周。30℃组直接置于30℃环境饲养8周,4℃组和-10℃组前3天置于18℃环境,4℃第4天至8周置于4℃环境饲养,-10℃组第4至7天置于4℃环境饲养,第2至8周每天置于-10℃环境饲养8小时,置于4℃饲养16小时。3.检测指标:1)一般测量:平均摄食量、体重、体长、心率、血压等2)呼吸代谢率测量:将小鼠用戊巴比妥钠麻醉后,置于呼吸代谢测量仪器中进行相应测量。3)糖耐量检测:小鼠饥饿8小时,腹腔注射葡萄糖,按时间点检测血糖浓度。4)胰岛素耐量检测:小鼠饥饿8小时,腹腔注射胰岛素,按时间点检测血糖浓度。5)组织样本取材:小鼠饥饿过夜,麻醉后取材。留取血清、各处脂肪组织,心脏、主动脉、肝脏等组织。用于组化研究的组织浸泡于4%多聚甲醛中固定。用于分子检测的组织浸泡于液氮中保存。6)血脂水平检测:检测小鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸等水平。7)组织学染色和免疫组织化学染色:脂肪组织和血管进行相应组织学染色,主要有HE染色观察组织形态、油红O染色检测脂质含量、天狼星红染色观察胶原水平。免疫组织化学染色,检测脂肪组织内脂滴包被蛋白、线粒体、炎症浸润、血管等水平。4.统计学分析:定量数据表示为均数±标准误,两组比较应用双侧t检验,三组及以上应用ANOVA检验。设定p<0.05为有统计学差异。结果:1.极低温度能够显著激活脂肪组织。从对脂肪组织的分析中可以看出,ApoE-/-小鼠在-10℃环境饲养一段时间后,内脏白色脂肪组织体积显著缩小,重量减轻,细胞直径缩小,脂滴减小,拥有更丰富的线粒体,UCP1表达增加。这些证据表明,-10℃可以显著激活内脏白色脂肪组织。2.极低温度能够提高小鼠胰岛素敏感性和代谢水平。实验结果显示,-10℃环境能够提高胰岛素敏感性,提高呼吸代谢率,提示其激活脂肪组织后能够显著提升代谢水平。3.极低温度能够显著促进动脉粥样硬化斑块面积和不稳定性。从对ApoE-/-小鼠主动脉染色等实验结果分析来看,米拉贝隆能够显著增加动脉粥样硬化斑块面积,增加斑块不稳定性和坏死核面积。结论:1.极低温度可以显著激活内脏白色脂肪组织2.极低温度可以显著促进脂降解,增加ApoE-/-小鼠血中LDL-C水平3.极低温度可以通过激活内脏白色脂肪组织,显著加重ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变程度意义:北方地区冬季严寒,极低温度下人体脂肪被激活,对于有血脂代谢异常的人,更易发生心脑血管事件,这一发现表明了内脏脂肪激活与动脉粥样硬化之间有重要联系,提示寒冷地区,对高危心血管事件需格外关注。