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目的:以慢病毒介导的Keap1基因沉默的人角质形成细胞株Ha Ca T细胞为模型细胞,研究Nrf2对角化相关基因和砷代谢相关指标的影响及在砷致皮肤毒性中作用,为砷致皮肤毒性机制提供理论依据。方法:1.Keap1 shRNA的构建:利用RNAi技术,以人Keap1基因为靶基因,设计Keap1基因特异性的小干扰RNA,构建其shRNA,重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。2.慢病毒包装:用重组成功的表达载体转染包装细胞293T,收集、浓缩病毒上清液、测定其滴度;3.Keap1沉默Hacat细胞模型的构建,构建好的三种慢病毒分别感染HaCaT细胞(MOI=5),感染48小时后,用1ug/ml的嘌呤霉素筛选稳定细胞株。4.稳定细胞株的鉴定:筛选出稳定的细胞株,用实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测干扰效率。5.细胞培养与染毒:模型细胞与正常细胞按细胞常规培养方法培养。6.MTT法检测细胞生长状况,确定染毒浓度,染毒浓度别为LC50的1/100、1/50、1/10。7.流式细胞仪检测细胞的凋亡情况:参照相关试剂盒说明书。8.实时荧光定量PCR检测细胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表达水平。9.ELISA法检测细胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表达水平。结果:1.慢病毒干扰载体构建测序结果显示重组载体构建成功。2.慢病毒滴度测试结果:依据滴度(TU/ml)=细胞数×百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×10^3选取最佳滴度的病毒。3.选取Keap1 shRNA1 Hacat细胞,其基因的沉默效率为71%。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L,分别为低、中、高剂量组,阴性对照组和空白对照组染毒浓度为0μmol/L。5.细胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,细胞明显增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒细胞72h开始出现明显抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒细胞48h开始明显抑制细胞增殖。空白对照细胞增值率略低于0μmol/L染毒组。6.细胞凋亡:2.90μmol/L染毒时,各时间段细胞凋亡率均低于正常对照组,提示2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,在促进细胞增殖同时,诱导细胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒组随着染毒剂量的增加,细胞凋亡率也逐渐增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞8h、24h后能促进Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表达上调;29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默细胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞能促进N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表达;29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞N6AMT1、SAM、HCY蛋白的表达量下降差异有统计学意义(P<0.05);29.00μmol/L COX-2蛋白的表达量仍远于对照组且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.细胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,细胞明显增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒细胞72h开始出现明显抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒细胞48h开始明显抑制细胞增殖。空白对照细胞增值率略低于0μmol/L染毒组,提示沉默Keap1基因后Nrf2高表达有利于细胞的增殖,混合砷液对细胞的增殖影响具有时间-剂量依赖性。细胞凋亡:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,在促进细胞增殖同时,诱导细胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒组随着染毒剂量的增加,细胞凋亡率也逐渐增加;随着染毒时间的延长,细胞的凋亡率也上升,提示混合砷液诱导细胞凋亡具有一定的时间-剂量依赖性。2.混合砷染毒Keap1沉默Ha Ca T细胞,Nrf2处于高表达状态,随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因有下调趋势,但明显高于未转染组。3.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T细胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表达发生改变,随着染毒时间延长、染毒浓度增加能使基因表达逐渐下调。4.Keap1沉默Ha Ca T细胞染毒后在8h、24h检测到LORmRNA表达为阴性,2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒组在72h检测到LOR mRNA上调,29.00μmol/L组在48h、72h检测到LOR mRNA上调。5.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T细胞中N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白表达发生改变:随着染毒时间延长、染毒浓度增加表达量逐渐下降。6.混合砷液对Keap1沉默HaCa T细胞的毒性作用受时间和浓度交互作用的影响,可推测砷暴露随着染毒时间的延长,染毒浓度的加大对皮肤细胞的损害越严重。