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目的:1.使用Alexa Fluor R Red检测RNAi MAX对神经干细胞的转染效率,确定最终的转染效率最高的时间。2.观察mi R-31对神经干细胞向运动神经元分化时所起作用,研究mi R-31和神经干细胞之间的相互关系。方法:第一部分:RNAi MAX对神经干细胞的影响及转染效率的测定首先从胎鼠体内获得脊髓源神经干细胞,体外分离培养并鉴定。当干细胞传至3代后,接种于铺设多聚赖氨酸处理过盖玻片的六孔板中,分为不加RNAi MAX组和加RNAi MAX两组,通过0d、1d、2d和3d的连续观察,研究RNAi MAX对神经干细胞的影响作用。并继续将细胞分为1d、2d和3d三组,转染Alexa Fluor R Red观察RNAi MAX对神经干细胞的转染效率。当达到相应的时间点时,取出细胞并用多聚甲醛固定,之后将细胞位于荧光显微镜下观察,计算发出红色荧光细胞和总细胞数之比确定RNAi MAX对神经干细胞的转染效率。第二部分:mi R-31对神经干细胞的诱导作用将细胞分为干扰组、干扰对照组、过表达组、过表达对照组和对照组,转染相应试剂后观察细胞的形态学变化,并通过Ch AT的免疫细胞化学染色观察胆碱能神经元的分化情况。提取RNA后检测mi R-31的诱导是否成功,并反转录为c DNA后通过荧光定量PCR检测下游基因在mi R-31的表达变化后的变化情况。通过以上分析mi R-31在神经干细胞干性维持方面的作用。结果:第一部分:当RNAi MAX加入到神经干细胞后,细胞开始死亡。通过在时间节点镜下观察可知,在第一天时转染效率是20%-30%,第二天时转染效率是40%-55%,当达到第三天时,转染效率为60%-75%。说明Alexa Fluor R Red会随着时间的推移增加转染的细胞数,提高细胞的转染效率。第二部分:转染mi R-31的mimic和inhibitor后,细胞的形态和分子层面都发生了变化。形态学方面可以看出,转染mi R-31的抑制剂后,细胞的形态更接近于运动神经元,细胞呈长梭形,在免疫细胞化学染色中可以看出Ch AT的表达升高,细胞荧光呈强阳性;而在转染mi R-31过表达试剂后,细胞贴壁后形态变化不明显,突起伸出不多,Ch AT的表达明显降低,荧光强度明显弱于抑制组。micro RNA的反转录产物荧光定量PCR结果显示干扰组的表达为0.867,干扰对照组的表达为2.406,过表达组为1.022×106,过表达对照组为1.506×105,说明细胞转染成功。而下游基因也有明显变化。在干扰组中表达明显升高的有hb9和stmn1,表达降低的有Nestin、lats2、Rhobtb和SATB2。过表达组明显升高的有Nestin、hb9、lats2和SATB2,表达降低的基因有Rhobtb。结论:1.RNAi MAX对神经干性毒性较大,会造成大量的细胞死亡,在实验时需加大细胞的用量。通过转染效率的测定,RNAi MAX在第三天的转染效率最高。2.mi R-31高表达对神经干细胞有很好的干性维持作用,抑制时神经干细胞向运动神经元的分化增加。