心肌梗死是由于冠状动脉阻塞、心肌缺血所致的心肌不可逆性坏死,已成为人民群众健康的重要威胁,我国每年有数百万人死于心肌梗死及其并发症。虽然目前的各种血运重建术的不断发展(如及时溶栓、内科介入和外科搭桥等)已经使急性心肌梗死的死亡率出现一定程度的下降,但是对于相当一部分错失治疗时机或多支冠脉病变的患者目前临床上缺乏有效治疗手段。新近研究表明心肌梗死后机体内多种干/祖细胞可以在基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α, SDF-1a)的吸引下归巢至梗死区,分化为心肌或血管细胞,同时释放多种内分泌因子,改善梗死区域的微环境,抑制细胞凋亡,促进组织的修复。遗憾的是SDF-1α释放的数量有限且维持时间短暂因而修复能力很弱,无法代偿心肌细胞的缺失和心梗所导致的心室重构。介于此,本研究拟利用SDF-1α基因转染心肌,使SDF-1α高效表达,诱导更多干细胞心肌归巢治疗心肌梗死,为冠心病的干细胞治疗提供一条新途径。要想使SDF-1α基因高效表达就必须构建高效的基因转载体系,提高转染效率。既往研究表明外源基因要想进行有效的表达至少需要克服以下三方面的问题：(1)外源性基因能逃避机体免疫系统的清除,顺利到达靶细胞；(2)细胞膜是外源性基因导入的第一道主要屏障,基因须顺利穿过细胞膜进入胞浆；(3)胞核的核膜是第二道屏障,基因必须有适当的机制穿过核膜进入细胞核。由于核膜是外源性基因转导的一个壁垒,因此基因进入细胞核是一个高度限制性的过程,也是一个主动耗能的过程。小分子如离子等可通过被动扩散的方式进入核内,但是大分子如质粒DNA入核则需要输入信号协助。基于以上三方面的障碍,本研究有针对性地设计了新型载体系统以帮助SDF-1α基因转染顺利进行。(1)采用阳离子微泡作为基因载体,通过静电吸附法增加微泡对基因的携带率,同时保护基因免遭体内免疫系统清除,使基因能顺利到达靶细胞；(2)通过超声靶向微泡破坏技术(ultrasound targeted microbubble destruction、UTMD)使SDF-1α基因在心肌组织靶向释放,同时利用UTMD的生物效应帮助外源性基因穿过细胞膜进入胞浆；(3)利用NFKB核定位基序的核输入功能帮助胞浆中的SDF-1α基因进一步突破核膜屏障进入细胞核内进行基因复制和后续表达。本研究通过增加基因的入胞和入核效率,提高SDF-1α基因转染效率,使更多干细胞动员剂SDF-1α释放入血,从而增加干细胞归巢效应,增强心肌梗死疗效。本研究分三部分。第一部分phSDF-1α-NFκB真核表达质粒的构建目的：构建含人基质细胞衍生因子1α(hSDF-1α)基因的真核表达质粒phSDF-1α,在phSDF-1α质粒中插入NFκB核定位基序构建具有核输入功能的真核表达质粒phSDF-1a-NFκB,大量提取质粒,为后续实验做物质准备。方法：从人成纤维细胞获取总mRNA,经RT-PCR合成hSDF-1a DNA。用Nhel/EcoRI限制性内切酶切开质粒pcDNA3.1(-),在相同的酶切位点插入hSDF-1α基因,用DNA酶连接,构建phSDF-1α质粒。在SDF-1α引物前插入NFκB基序：(5’-CTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGG GACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCT-3’),按照上法合成SDF-la-NFκB DNA,用限制性内切酶BamHI/HindⅢ切开质粒pcDNA3.1后,将SDF-1α-NFκB DNA插入相应的酶切位点,T4DNA连接酶进行连接,构建phSDF-1α-NFKB质粒。构建成功的质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞内扩增,筛选阳性克隆,经过酶切电泳鉴定和DNA测序证明所构建质粒的正确性。测序正确的质粒用无内毒素质粒大提试剂盒大量制备。结果：phSDF-1α和phSDF-1α-NFKB质粒经酶切鉴定均可得到与预期大小相符的目的条带,基因序列测定显示真核表达质粒phSDF-1α和phSDF-1α-NFKB开放阅读框架正确,目的基因序列与Genebank报道一致,说明质粒构建成功。结论：利用基因克隆重组技术能成功将SDF-1α基因和NFκB核定位基序克隆入pcDNA3.1载体中,构建含SDF-1α基因的真核表达质粒phSDF-1α以及具有核输入功能的SDF-1α目的基因质粒phSDF-1α-NFKB。第二部分超声微泡联合NFκB核定位基SDF-1α基因突破胞膜和核膜屏障提高转染效率的体外实验目的：胞膜和核膜是限制外源性基因进入的两大屏障,也是导致非病毒载体转染效率低下的重要原因。鉴于此,本研究有针对性地设计了一个新型双靶向转导系统来提高SDF-1α基因转染效率：(一)利用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术促进基因突破细胞膜进入细胞；(二)利用核因子κB(NFκB)核定位基序帮助胞浆内的SDF-1α基因进一步突破核膜进入细胞核。方法：构建SDF-1a目的基因质粒载体phSDF-1α,在phSDF-1α质粒中插入一段特异性的DNA核定位序列---转录因子NFκB结合基序,构建NFκB核定位基序质粒phSDF-1α-NFκB。用核酸染料Cy3标记两组质粒后在UTMD介导下分别转染人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,流式细胞仪检测在UTMD及非UTMD作用下Cy3阳性细胞率以评价UTMD对质粒入胞效率的影响,荧光显微镜观察Cy3标记的两组质粒在细胞核内分布情况以比较NFκB核定位基序对质粒入核率的影响,RT-PCR和Western Blot、ELI SA分别从基因和蛋白水平检测SDF-1α目的基因的表达效率,进而探讨UTMD和NFκB核定位基序对SDF-1α基因转染的促进作用。结果：UTMD能显著提高质粒的入胞效率(81%±7%)同时保持较高细胞存活率(86%±6%)。phSDF-1α-NFKB和phSDF-1α转染组的质粒入核效率分别为72%±12%和14%±5%,ELISA结果显示两组蛋白表达量分别为(63±10) ng/mg蛋白和(15±5) ng/mg蛋白,差异均具有统计学意义(均p<0.01)。与phSDF-1α转染组相比,结合有NFκB结合基序的phSDF-1α-NFκB转染组质粒入核效率增加4倍,SDF-1α蛋白表达效率提高约3倍。结论：UTMD联合NFκB核定位信号能分别增强SDF-1α基因的入胞和入核效率,提高基因转染效率。第三部分超声靶向破坏阳离子微泡联合NFκB核定位基序促进SDF-1α基因转染治疗心肌梗死目的：利用超声靶向破坏阳离子微泡(UTMD)联合NFκB核定位基序提高SDF-1α基因体内转染效率,诱导干细胞心肌归巢,治疗心肌梗死。方法：构建家兔心肌梗死模型并分组进行基因转染治疗。A组：UTMD+NFκB核定位基序+SDF-lα基因转染组；B组：UTMD+SDF-1α基因转染组；C组：SDF-1α基因转染组。建模后1天及转染后1月分别行超声检查,二维超声心动图检测各组家兔室壁运动情况和射血分数,心肌声学造影检查各组家兔心肌血流灌注情况。转染后3天从三组各随机挑选家兔3只,取心脏标本,RT-PCR和Western Blot, ELISA分别从基因和蛋白水平检测心肌组织SDF-1α基因的表达效率。转染后1月免疫组化检测心肌干细胞标志物CD31和CD34以评价干细胞归巢效应,FⅧ染色检测心肌毛细血管新生效应,Masson染色检测心肌梗死区瘢痕面积及纤维化程度。比较三组基因转染治疗效果。结果：心梗建模后1天,三组家兔均可见左室前壁运动明显减弱,射血分数明显减低,心肌造影均显示前壁心肌充盈缺损,三组间无明显差异(P>0.05)；转染后1月A组心功能轻度增高,B组轻度减低,C组明显恶化,心肌造影显示A组梗死及周围区较多造影剂充填,B组少许造影剂充填,C组充盈缺损,三组间差异有统计学意义,进一步两两比较,A组强于B组,B组强于C组(均P<0.01)。转染后3天,RT-PCR半定量检测结果显示A组SDF-1α mRNA表达是B组的2.5倍,B组是C组的6倍；Western Blot结果显示三组间SDF-1α蛋白表达趋势与RT-PCR结果一致；ELISA结果显示A、B、C三组SDF-1α蛋白表达量分别为(233±64)pg,(125±55)pg和(57±48) pg/mg蛋白,A组基因转染效率是B组的2倍,C组的4倍。免疫组化结果显示CD31和CD34阳性染色A组强于B组,B组强于C组,FⅧ染色显示A组可见较多新生毛细血管,B组可见少许新生毛细血管,C组几无明显新生毛细血管,三组毛细血管密度分别为46.4±6.8,21.7±5.4和4.1±1.8个/高倍镜视野。Masson染色显示A组梗死区厚度、瘢痕面积和心肌纤维化程度均较B、C组明显改善。结论：UTMD联合NFκB核定位基序能提高SDF-1α基因转染效率,促进干细胞归巢,增强血管新生,抑制心肌纤维化,增强心肌梗死的疗效。