赤眼鳟TLR19结构和功能特性研究

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由草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病严重制约草鱼养殖业的健康发展。赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)与草鱼(Ctenopharymgodon idellus)同属雅罗鱼亚科,较草鱼表现出更强的抗GCRV能力。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)作为模式识别受体,其能有效识别病原相关分子模式来激活免疫反应。本研究克隆与鉴定赤眼鳟TLR19(ScTLR19)基因,并对其结构和抗GCRV功能特性进行研究,主要研究结果如下:1.ScTLR19基因的cDNA克隆及序列分析结果ScTLR19基因全长3230 bp,包括5’端非编码区域(UTR)84 bp,ORF编码区域2871 bp和3’端非编码区域275 bp,共编码957个氨基酸。Expasy预测ScTLR19蛋白分子量为109.528 k D,理论等电点为5.99。Blast比对和系统进化树结果显示赤眼鳟TLR19与草鱼TLR19(Ci TLR19)具有高度相似性和同源性。ScTLR19无信号肽,SMART结构域预测显示ScTLR19由1个TIR结构域、跨膜域和9个亮氨酸重复序列(LRR)组成。ScTLR19三级结构由15个α-螺旋和17个β-折叠构成。这些结构结果为研究其功能特性奠定理论基础。2.ScTLR19基因的表达特性结果在肠、肝、肌肉、皮肤、脾、鳃、肾脏、头肾8个健康组织中,ScTLR19基因均有表达,且在皮肤和肌肉的表达量最高,头肾和肾脏次之,而在肠、肝、鳃和脾组织中表达水平较低。GCRV攻毒后,赤眼鳟肾脏、脾脏和肝脏组织中ScTLR19基因的表达水平总体呈现先上升后下降的趋势,且均出现一个最高表达峰。此外,与对照组相比,肾脏组织中ScTLR19在攻毒各时间点的表达水平显著上调,脾脏组织在攻毒各时间点的表达水平无显著差异,而肝脏组织中ScTLR19基因在实验组12 h、72 h和168 h的表达水平显著下调。总之,ScTLR19在接受GCRV刺激后作为PRR基因可能主要在肾脏中发挥免疫功能。3.ScTLR19抗GCRV免疫功能的特性分析(1)赤眼鳟鳍条细胞系过表达野生型ScTLR19并接受GCRV攻毒后,干扰素调节因子IRF7在攻毒期间的表达水平与对照组无显著差异,而干扰素调节因子IRF3在攻毒12 h和24 h的表达水平显著上调(P<0.05),且衔接蛋白My D88和TRIF的表达水平均显著上调(P<0.05)。因此,ScTLR19只对IRF3而不对IRF7进行调控,其可能同时对My D88和TRIF二者进行调控,从而介导更多样的抗病毒免疫反应。(2)缺失型ScTLR19瞬时转入SCF并用GCRV攻毒后,IRF3、IRF7、TRIF和My D88基因在12 h-48 h之间的表达水平趋势为先下调后增长;而野生型ScTLR19过表达后,IRF3、TRIF和My D88基因的相对表达量在12 h-48 h期间先上调后下降。说明胞外段LRR的结构特征可能决定了其免疫识别功能。研究结果为深入剖析赤眼鳟与草鱼在GCRV刺激下所发挥的不同策略机制提供线索。
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