苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020包含3个内生大质粒,本课题组前期从质粒p26上克隆到一类新型的复制子,该复制子共由两个ORF组成：ORF15和ORF16。序列比对发现,orf15编码一个未知功能蛋白,预测这个蛋白可能是一类新型的复制蛋白；orf16编码一个与PcrA解螺旋酶的7个保守结构域有很高同源性的蛋白,故命名为PcrA26。为了证明ORF15蛋白是否是一个新型的复制蛋白,同时明确PcrA26蛋白是否具有解螺旋酶的功能,以及它们在p26复制过程中所执行功能的机制,开展了本研究。1.通过预测知道p26质粒的ORI位点位于orf15的内部,然后利用PGE超量表达系统在大肠杆菌中表达纯化了ORF15蛋白；在体外将ORF15蛋白与前面预测含有ORI位点的DNA片段进行结合实验,结果证明ORF15蛋白能够与该DNA相结合并具有复制起始蛋白的功能,故将ORF15命名为Rep26;2.通过酵母双杂交实验验证Rep26蛋白和PcrA26之间的相互作用及其各自之间的聚合作用,结果表明Rep26可以自身聚合成寡聚体,推测这个蛋白除了和复制起始相关外,还可能与p26质粒的分离机制相关,是一个杂合功能蛋白。PcrA26自身不能聚合,说明PcrA26是以单体的形式起作用；PcrA26和Rep26没有相互作用关系,推测PcrA26执行解螺旋酶的功能不依赖复制蛋白。本研究初步鉴定了p26的复制子的功能,Rep26是一类新型的复制起始蛋白,同时推测这个蛋白在质粒的分离中起作用,是一个具有复制和分离的双功能蛋白。PcrA26在θ复制中执行功能时是以单体形式起作用的,并且被招募时不需要Rep蛋白的参与,推测PcrA26蛋白直接和复制区的DNA相结合,基于以上证据推测p26质粒可能存在一种新的复制机制。