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抗菌肽已作为兽药和饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而,目前关于抗菌肽等生物药物对药物代谢酶的表达调控研究十分有限,导致联合用药过程中出现疗效欠佳、安全性下降等问题。随着抗菌肽的不断开发应用,了解和研究其对细胞色素P450酶(Cytochrome P450)的影响具有重要的意义。CYP3A29是猪体内最重要的细胞色素P450酶,含量约占机体总P450酶含量的30%左右,代谢超过50%的外源性物质,其活性的微小变化都将影响药物的疗效,结构及代谢特征与人CYP3A4相似,已被证明是CYP3A4的重要研究模型。本研究发现天蚕素抗菌肽Cecropin B通过TLRs(Toll-likereceptors)进行跨膜信号转导,调控转录因子NFκB及下游核受体PXR(Pregnane X Receptor)、RXR-α(Retinoid X Receptorα),从而调控猪CYP3A29的表达。该研究结果将为兽医及人医临床合理用药及更好的应用抗菌肽等生物药物提供理论指导及分子基础。本课题取得的主要研究结果如下:1.Cecropin B对CYP3A29及PXR、RXR-α的表达调控作用研究为了检测Cecropin B对CYP3A29及PXR、RXR-α的表达的影响,通过RT-PCR、Western Blot检测了猪肝脏原代细胞和传代细胞系Hep Li中Cecropin B在不同时间及不同剂量条件下对CYP3A29及PXR、RXR-α的表达量的影响,结果表明:Cecropin B在一定浓度和时间范围内能显著抑制CYP3A29及PXR的表达,且两者之间的变化趋势具有相关性,提示CYP3A29的表达与PXR有关;Cecropin B对核受体RXR-α的表达无影响。为了验证PXR、RXR-α在Cecropin B抑制CYP3A29表达过程中是否发挥作用,采用PXR超表达试验及PXR的Si RNA干扰试验验证了Cecropin B通过抑制PXR的表达来抑制CYP3A29的表达;通过Western Blot对RXR-α的蛋白分布进行检测及通过RXR-α的Si RNA干扰试验验证了Cecropin B通过诱导RXR-α蛋白出核从而抑制由PXR介导的CYP3A29的表达。该部分结果表明Cecropin B对CYP3A29的抑制作用是由PXR、RXR-α共同介导的。2.Cecropin B对CYP3A29启动子水平的调控作用研究为了从转录水平上分析核受体PXR、RXR-α介导的Cecropin B对CYP3A29的表达调控作用,进行了以下试验:通过转录抑制试验证明了Cecropin B对CYP3A29的表达调控是从启动子水平上实现的;构建CYP3A29的启动子报告质粒,双荧光试验检测发现Cecropin B能够抑制其活性;通过JASPAR软件预测CYP3A29启动子区存在PXR/RXR-α二聚体结合位点,对预测位点进行定点突变试验及染色质免疫共沉淀试验,在CYP3A29的启动子区确定了PXR/RXR-α二聚体的结合位点。该部分结果表明Cecropin B通过抑制PXR/RXR-α二聚体对CYP3A29启动子的结合而抑制CYP3A29的转录。3.Cecropin B对NF-κB/PXR的激活作用研究为了检测核受体PXR/RXR-α二聚体上游信号对PXR的调控,分析了转录因子NF-κB发挥的作用,得到的结果如下:通过转染NF-κB p65超表达质粒发现NF-κB p65具有抑制CYP3A29和PXR的表达的作用;转染NF-κB p65报告质粒,并用Cecropin B刺激细胞,发现Cecropin B激活了NF-κB p65;用NF-κB抑制剂BAY117082抑制Hep Li细胞内NF-κB核转位之后,Cecropin B对CYP3A29和PXR的作用消失;Hep Li细胞转染NF-κBp65-EGFP发光质粒后用Cecropin B刺激细胞,发现NF-κB p65发生了核转位现象。上述结果表明NF-κB被激活,表达量升高,并发生核转位,抑制PXR、CYP3A29的表达。构建PXR的启动子报告质粒,通过JASPAR软件预测、染色质免疫共沉淀试验(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)在PXR的启动子区找到了NF-κB的结合位点,表明NF-κB对PXR具有转录抑制的作用。该部分结果表明Cecropin B通过激活NF-κB抑制PXR的转录来调控CYP3A29的表达。4.Cecropin B对NF-κB/RXR-α的激活作用的研究在已知NF-κB通过抑制PXR启动子活性来调控CYP3A29表达的基础上,结合RXR-α的出核现象,并通过免疫共沉淀试验(Co-Immunoprecipitation,Co IP)检测到NF-κB能够结合RXR-α,提示Cecropin B能使NF-κB与PXR竞争性结合RXR-α,使其出核,抑制PXR/RXR-α二聚体的形成。该部分结果表明Cecropin B通过第二条信号通路即NF-κB/RXR-α信号通路调控CYP3A29的表达。5.Cecropin B对TLRs/NF-κB的激活作用的研究为了检测Cecropin B的跨膜信号转导作用,设计合成TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干扰分子,转染Hep Li细胞后用Cecropin B刺激,荧光定量检测CYP3A29和PXR的表达,发现干扰了TLR2、TLR4、TLR5之后,Cecropin B对CYP3A29的作用被削弱;TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6干扰分子与NF-κB p65报告质粒共转染Hep Li细胞后用Cecropin B刺激,检测NF-κB p65报告质粒的活性,结果显示干扰了TLR2、TLR4、TLR5之后,Cecropin B对NF-κB p65报告质粒的荧光素酶活性失去了激活作用;293T细胞中转染CYP3A29启动子报告质粒后用Cecropin B刺激细胞,结果显示Cecropin B对CYP3A29启动子报告质粒并没有表现出抑制作用。上述实验表明Cecropin B通过TLR2、TLR4介导NF-κB及下游信号传递。