研究背景高新技术发展迅猛，军事领域中各种新概念武器不断被研发，激光致盲武器就是其中之一。同时，高新技术给医学领域也带来了崭新的革命，在眼科领域中出现了诸如：激光矫正治疗屈光不正，激光手术治疗白内障，激光治疗眼底视网膜病变等等，这些高新技术的出现极大的推动了眼科学的发展，也给无数的病患带来了福音。但是，伴随着这些有利因素，高新技术的不适使用、过度应用等由此带来的一些不利因素也逐渐显现出来。眼睛对外来的光线极为敏感，它最容易受到强光照射而引起损伤。将一束400－900纳米波长范围的激光向角膜照射，经过屈光介质的汇聚后，单位区域视网膜上所吸收的激光照射能量比照射角膜的量提高近105倍。所以，因此，激光照射可引起视网膜损伤严重，导致视力下降和失明。一旦视网膜受损，如何减少视网膜的受损程度，恢复视功能成了人们关注的主要问题。强光照射后最初引起视网膜色素上皮层的改变，色素上皮层中的色素颗粒将吸收的光能转换为热能，这就破坏了视网膜色素上皮细胞之间的紧密连接，使它脱离Bruchs膜，导致血视网膜外屏障的损伤。研究表明，激光对视网膜的损伤与血－视网膜屏障损伤有直接的关系。血－视网膜外屏障损伤能够使脉络膜的组分渗漏到视网膜，引起视网膜水肿，导致视力急剧下降，甚至失明。水通道蛋白（AQPs）是最近发现的一种对水分子具备极高选择性的跨膜转运蛋白，主要分13种亚型(AQP0-12)，在不同的组织中广泛分布，能明显提高细胞膜对水的通透，促进水的分泌、摄取和维持细胞内外水的均衡，多种病理因素引起的组织水肿已被证明与其关系密切相关。作为含水量最多的人体器官，眼许多的生理功能都仰仗迅速、高效的水转运体系，水通道蛋白在其中起着十分重要的作用，包括参与房水循环、及维持角膜、晶状体的脱水状态等。纵观视网膜上的各亚型水通道蛋白，AQPl含量最高，主要表达于无长突细胞、色素上皮细胞和光感受器细胞，但它的具体作用还不明确。既往研究表明AQPs与血脑屏障的通透性密切相关，对调节脑内水平衡有重要作用。大脑神经中枢向外部分延伸为视网膜视神经，血视网膜外屏障和血脑屏障有很多的相似性：二者在极性蛋白的表达，转运功能，通透性方面有着惊人的相似处。因此，在视网膜组织中广泛存在的AQP1极有可能参与血视网膜外屏障的通透性的调节，并在激光损伤导致的视网膜水肿中发挥重要作用。本研究拟在建立大鼠视网膜激光损伤模型基础上采用免疫组化、Western-blot分析和RT－PCR技术确定AQP1在视网膜组织细胞中的表达及分布特征。体外对人RPE细胞进行培育，观察色素上皮细胞中AQP1的表达及变化；创建激光照射体外培养人视网膜色素上皮细胞模型，观测激光损伤对色素上皮细胞中AQP1表达的影响。从而探讨AQP1在激光所致视网膜水肿形成发展中的作用，并探讨其相关机制，以期为利用水通道蛋白作为药物靶点对激光视网膜损伤进行有效的治疗和预防提供一个新的研究方向和理论依据。目的1、体外建立人的视网膜色素上皮细胞的培养方法；2、观察体外培养的人视网色素上皮细胞上AQP-1的表达；3、观察激光照射后，体外培育的人视网膜色素上皮细胞中AQP-1表达的变化；4、观察鼠视网膜中AQP-1的表达在激光照射后发生的变化。方法1、视网膜激光损伤模型的建立。视网膜激光损伤模型的建立方法：单眼充分散瞳，眼前放盖玻片接触角膜，进行散瞳眼视网膜激光光凝，每只眼在视盘1.5－2个视盘直径外4个象限均匀光凝50个点。氩激光参数设置：波长532纳米，曝光时间0.1秒，光斑光斑为50um，能量100mw，正常眼为对照分析。2、体外培养人视网膜色素上皮细胞：选取新鲜的健康人角膜移植供体眼球，用生理盐水+庆大霉素冲洗人眼球，剪刀剔除眼外结缔组织。在角膜缘后约1-2mm处剪刀环形切开，并依次清除角膜，虹膜，晶体，玻璃体及视网膜神经上皮层，暴露出视网膜色素上皮层。用D-Hank’s液冲洗后节眼杯2遍，0.25%胰蛋白酶37.5℃消化半小时×2次，得到视网膜色素上皮细胞悬液，加入新鲜胎牛血清终止消化，收集悬液以1000转/分钟离心10分钟×2次后得到视网膜色素上皮细胞，滴加含有20%胎牛血清的D-F12培养液，接种到25ml培养瓶中培养。用反复贴壁法纯化该细胞。3、激光损伤体外培养人视网膜色素上皮细胞模型的建立。选取第4-5代培养的人视网膜色素上皮细胞，复苏后按1×105细胞密度接种于6孔板中，放置含5%CO2、95%空气、湿度为90%的37.5℃孵箱中孵育，第二天，观察到贴壁生长的细胞，伸出伪足，呈不规则状。4-5天后孔板中的细胞基本融合呈一单细胞层，吸净培养液，垂直置于视网膜激光分离仪前进行激光照射损伤，激光照射后按照损伤后即刻、12小时、24小时、72小时及正常细胞5个不同时间点收集细胞，细胞离心后，去除上清液，收集细胞沉淀放置-80℃深低温冰箱中保存。氩激光参数设置：波长532纳米，功率150mw，直径100um，曝光时间0.15s。4、应用免疫组织化学法(亦称免疫组化法)、实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹（Western Blot）法观察激光损伤后不同时间鼠视网膜中AQP1的分布及其mRNA和蛋白表达的变化。5、应用实时荧光定量PCR的方法观察激光损伤后不同时间体外培育的人RPE细胞中AQP-1表达的变化。结果1、人视网膜色素上皮细胞形态特征原代的人视网膜色素上皮细胞在48-72小时后基本上能够贴壁呈扁平生长，部分伸出伪足，呈不规则多角形状，倒置显微镜下看不清细胞核，胞浆中含有丰富的黑色素颗粒，1周左右，贴壁的细胞基本融合形成一单细胞层，可见圆形的细胞核，细胞胞质内富含黑色素颗粒。每传代一次，胞质中的黑色素逐渐变淡，至第6代左右，细胞趋于透明。2、激光照射体外培养人RPE细胞后不同时间AQP-1的表达特征实时荧光定量PCR结果显示，正常组细胞中AQP1mRNA表达量(CtAQP1/CtGAPDH)为：24.63±0.15，激光损伤组分别为：即刻：25.75±0.35，激光损伤后12小时：25.82±0.10，激光损伤后24小时：25.67±0.19，激光损伤后72小时：25.19±0.12，与正常组相比，激光损伤即刻、12小时、24小时及72小时均有统计学意义(p0.001)。激光损伤72小时组与激光损伤即刻、12小时及24小时组相比有统计学意义（p0.05）。3、激光照射损伤鼠视网膜中AQP-1的表达特征免疫组化染色检测鼠眼视网膜组织，神经节细胞层与内核层细胞均出现阳性的棕色粗大颗粒，揭示AQP-1在眼视网膜组织内在这两个部位呈阳性表达。实时荧光定量PCR结果显示，正常组AQP1mRNA表达量为：1.15±0.01，激光损伤即刻：1.10±0.01，12小时：1.10±0.03，24小时：1.16±0.01，72小时：1.13±0.01。与正常对照组比较，激光损伤即刻(p=0.0010.05)与激光损伤12小时（p=0.001）有统计学意义。Western Blot结果显示： AQP-1的表达在激光损伤后即刻组（1.25±0.35，p=0.04），12小时组（1.06±0.33，p=0.17），24小时组（1.87±0.38，p=0.00），72小时组（1.15±0.36，p=0.09），与正常组视网膜中AQP1的表达（0.73±0.17）统计分析发现，激光损伤后即刻组和24小时组差异有统计学意义（p0.05）。结论1、激光损伤条件下，RPE中AQP-1mRNA的表达呈动态改变，即在激光损伤初期呈上调，至损伤后12小时达到最大值，后期随着时间的延长呈下调表达。2、激光损伤条件下，体内视网膜中AQP-1蛋白的表达呈动态改变，在激光损伤初期表达上调，至损伤后24小时达到最大值，后随着时间的延长表达下调。