第一部分：青藤碱对TNF- a诱导的人脐静脉内皮细胞免疫炎症的抑制作用和意义的探讨。 研究目的： 以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型，探讨SIN对TNF-α诱导的NF-κ Bp65核转移、VCAM-1表达信号传导通路和内皮细胞与淋巴细胞的黏附等免疫炎症的影响。探索SIN用于RF，尤其是风湿性心脏炎治疗的可行性。 方法： 1.细胞分离和培养参阅Jaffe操作程序，使用胰蛋白酶从新鲜的脐带中分离HUVECs。 2.SIN的细胞毒性分析通过观察细胞形态、检测细胞活性以确定SIN对细胞的毒性。 3.细胞的刺激与干预刺激与干预试验孵育时间选定为12 hrs，流式细胞仪检测VCAM-1表达的实验增加6 hrs和124 hrs刺激与干预时点。TNF-α终浓度为10ng/mL。(阴性)对照组用3％CS-M199培养，不加TNF-α和SIN。 4.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞核提取物中NF-κ Bp65水平25cm<2>培养瓶HUVECs全部汇合后，按上述分组进行细胞的刺激与干预。 5.实时定量PCR(RT-PCR)检测VCAM-1 mRNA本研究设计的探针是TaqMan探针，探针的5’端标记荧光发光基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。VCAM-1引物序列为上游5’-CATGGAATTCGAACCCAAACA-3’;下游5’-GGCTGACCAAGACGGTTGTA-3’。探针由TAKARA公司合成，序列如下：5’-CAAACACTTTATGTcAATGTTGCCCCCA-3’。 6.流式细胞仪检测VCAM-1细胞接受上述刺激与干预后，收获细胞。 7.内皮细胞与淋巴细胞黏附试验。 8.统计学方法实时定量PCR所获原始数据进行对数(Lg)转换后再进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±S)表示。两个独立样本均数比较采用T检验。组间均数比较采用方差分析(ANOVA)。以p<0.05为具有显著差异。 结论： 1.不同浓度的SIN(0.25 mol/L、0.5mol/L、1.0 mol/L)和Dex(1.0×10<6>mol/L)均抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞的NF-κ Bp65核转移。SIN的此种抑制作用呈剂量依赖性。 2. SIN可在基因水平和蛋白水平上抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1的表达；Dex能协同SIN的这种抑制作用，Dex对VCAM-1的抑制可能存在细胞株间的个体差异。 3. SIN可抑制TNF-α诱导的内皮细胞与淋巴细胞的黏附。抑制内皮细胞VCAM-1的表达可能是SIN抑制淋巴细胞与内皮细胞黏附的分子机制之一。 总之，作为体外研究，本研究提示SIN有作为针对风湿性心瓣膜炎涉及的内皮细胞免疫炎症的治疗药物的潜在可能，值得进一步研究。 第二部分：风湿性心脏炎动物模型的初步研究 。 研究目的： 探讨以Lewis大鼠为实验对象，用皮下注射灭活的A组链球菌全菌体抗原的方法诱导风湿性心脏炎动物模型的可行性。为进一步开展风湿性心脏炎免疫炎症调控机制的研究提供平台。 材料和方法： 1.实验对象： 实验动物Lewis大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。均为雌性，7周龄用于实验，体重152g-173g。 2.实验方法： 2.1.抗原制备复活本室保存的A组β溶血性链球菌(从风湿热患者咽喉部分离出，并经美国亚特兰大疾病控制中心鉴定<[129]>)，于心脑浸液液体培养基中繁殖，24小时后收获细菌。离心细菌悬液，细菌沉淀用无菌生理盐水洗3次。细菌沉淀加入10％福尔马林灭活12小时<[130,131]>，再用无菌生理盐水洗5次，离心后获灭活的A组链球菌全菌体抗原。用灭菌生理盐水悬浮，稀释制成1.2×10<11>CFU/mL。在无菌条件下，灭活A组链球菌全菌体抗原悬液和完全弗氏佐剂(CFA)按1：1(V/V)比例混合，摇匀，作为模型组注射用的抗原。在无菌条件下，生理盐水和CFA按1：1(V/v)比例混合，摇匀，作为对照组注射用的抗原。抗原分装后置4℃冰箱保存，备用。 2.2.实验动物分组和免疫方法Lewis大鼠分为3组：(1)对照组：4只，后足垫(掌面皮下)注射生理盐水/CFA混合液，每鼠0.2mL。初次免疫后1周，腹部皮下再次注射抗原1次，量同前；饲养至第3周时解剖动物；(2)模型A组：8只，后足垫(掌面皮下)注射灭活A组链球菌全菌体抗原/CFA混合液：每鼠0.2mL。初次免疫后1周，腹部皮下再次注射抗原1次，量同前；饲养至第3周时解剖动物；(3)模型B组：5只，后足垫(掌面皮下)注射灭活A组链球菌全菌体抗原/CFA混合液：每鼠0.2mL。初次免疫后分别于1、2、 3周时腹部皮下再次注射抗原，量同前；饲养至第6周时解剖动物。 委托中山大学实验动物中心在清洁级环境下饲养动物。 2.3.观察方法观察动物的体重、足关节活动情况、炎症程度、足垫厚度。检测血清抗链球菌溶血素“O”(anti-streptolysin O,ASO)、抗DNA酶B、C-反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)、抗心肌抗体IgG。全麻状态下解剖动物，取心脏、肾脏、肺脏和后足关节，按常规方法进行石腊切片和苏木素-伊红(H-E)染色，观察病理改变。 3.统计学方法所有计量用均数±标准差(x±S)表示。两个独立样本均数比较采用T检验。以P<0.05为具有显著差异。 结论： 1.后足垫皮下注射灭活A组链球菌全菌体抗原可诱发Lewis大鼠发生关节炎和心脏炎。 2.随着免疫时间的延长，在Lewis大鼠心脏间质的灶性炎症细胞浸润的程度加大，在第6周时趋于明显，同时还观察到心脏炎的心瓣膜炎症(渗出期)；以Lewis大鼠为对象，诱发典型的风湿性心脏炎病变(出现明显的类阿孝夫小体)，观察时间还需继续延长。