论文部分内容阅读
研究目的:盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)是以阴道分娩损伤、年龄增长、结缔组织老化或修复异常等多因素导致的盆底支持组织薄弱,引发盆腔器官(包括膀胱、子宫、阴道、直肠等)的位置和功能异常,不同程度地影响着患者的生活质量。大量研究发现,POP患者的盆底支持组织中总胶原蛋白含量明显减少,盆底支持组织的胶原蛋白由成纤维细胞合成及分泌,主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。目前Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的变化对POP患者的影响也得到广泛关注。Ⅰ型胶原,与组织韧性有关,直径较大。相对于Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ),Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)含量较少,与组织弹性有关,而且直径相对较小。Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例的增加可以增加胶原纤维直径并增加组织韧性;而Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的下降则会导致胶原纤维直径变小,韧性下降,弹性增加。自噬(autophagy)是细胞内的一种“自我吞噬”现象,是对细胞内的物质进行周转的重要过程,并且能通过溶酶体途径将细胞内受损、衰老或者变性的蛋白质或者细胞器进行消化降解。大量的文献表明,POP患者中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的数量减少,但造成胶原蛋白减少的机制却仍不清楚,那么胶原蛋白的减少和自噬的清除功能是否存在相关性,相关性如何,能否通过调控细胞的自噬活性增加胶原蛋白的数量,从而延缓POP患者的发生呢?为了探索上述假设,本论文以POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞为研究对象,先检测细胞内自噬相关蛋白(LC3、Beclin1)及胶原蛋白的表达,再利用饥饿诱导自噬和自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬后检测细胞自噬活性与胶原蛋白表达量的变化,对两者的相关性进行初步探索。研究方法:1.选取2017年6月-2018年12月在广州医科大学附属第三医院妇科接受手术治疗的POP患者及非POP患者的阴道壁组织,各10例,用胶原蛋白酶消化法对阴道壁成纤维细胞进行原代培养,并对其进行鉴定。2.POP患者与非POP患者均取第4-10代生长状态良好的阴道壁成纤维细胞,各组予10%胎牛血清、1%青链霉素的含糖DMEM/F12培养液正常培养5天,蛋白印迹(Western blotting)检测自噬相关蛋白(LC3和Beclin1)、胶原蛋白(ColⅠ和ColⅢ)的表达。3.透射电镜下观察POP患者阴道壁成纤维细胞中自噬体数量的变化。4.将生长状态良好的POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞,随机分成对照组(含糖含血清DMEM/F12培养液)和饥饿处理组(无糖无血清DMEM/F12培养液),培养4小时后,蛋白印迹检测LC3和Beclin1的表达。5.将生长状态良好的POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞,随机分成对照组(含糖含血清DMEM/F12培养液)、饥饿处理组(无糖无血清DMEM/F12培养液)和3-MA处理组(含糖含血清DMEM/F12培养液+10mmol/L 3-MA),培养4小时后,实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative Polymerase chain reaction,RT q-PCR)检测LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ在m RNA水平的表达,蛋白印迹检测LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ在蛋白水平的表达。研究结果:1.阴道壁组织于培养接种第3-5天可见细胞贴壁散在生长,分布不均的单个贴壁细胞呈梭形,边界清楚,待细胞培养第10-12天时,可见生长已达80%-90%的梭形贴壁细胞,呈鱼群样或漩涡状排列。免疫细胞化学染色鉴定第二代成纤维细胞,抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性,同时结合相应标本部位,证实为阴道壁成纤维细胞。2.在含糖含血清DMEM/F12培养液的正常培养下,POP患者的阴道壁成纤维细胞中与非POP患者相比较,LC3、Beclin1、ColⅠ和ColⅢ的蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3.透射电镜结果显示,POP患者的阴道壁成纤维细胞中,饥饿处理组较对照组自噬体数量增多;3-MA处理组较对照组自噬体数量减少。4.饥饿处理后,POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞中自噬相关蛋白LC3II蛋白表达量分别为(0.808±0.015)、(0.901±0.059),Beclin1的蛋白表达量分别为(0.750±0.049)、(0.980±0.044),表达水平上升,提示细胞自噬水平增加。5.POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞中,与对照组相比较,饥饿处理组LC3和Beclin1在m RNA水平的表达均上升,3-MA处理组LC3和Beclin1在m RNA水平的表达均下降。6.POP患者与非POP患者的阴道壁成纤维细胞中,与对照组相比较,3-MA处理组LC3蛋白表达量分别为(0.349±0.015)、(0.464±0.055),Beclin1的蛋白表达量分别为(0.140±0.049)、(0.340±0.036),表达均下降,提示3-MA作用下自噬水平下降。7.POP患者阴道壁成纤维细胞中,与对照组相比较,饥饿处理组和3-MA处理组Col I和Col Ⅲ在m RNA和蛋白水平的表达均呈下降,差异无统计学意义(P>0.05);但非POP患者饥饿组诱导自噬后,相较于对照组,Col I和Col Ⅲ在m RNA和蛋白水平的表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1.POP患者与非POP患者阴道壁成纤维细胞原代培养成功。2.POP患者的阴道壁成纤维细胞中自噬相关蛋白和胶原蛋白的表达低于非POP患者。3.饥饿诱导与3-MA药物均通过大自噬途径调节自噬水平,POP患者胶原蛋白的减少可能与其他自噬途径相关。4.非POP患者阴道壁成纤维细胞中自噬增强后胶原表达下降,推测未脱垂患者在自噬增强的影响下患POP风险可能性增高。