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前期研究发现,急性癫痫发作后小鼠皮层神经元树突水肿、棘突减少,并伴随肌动蛋白解聚因子cofilin磷酸化水平下降。cofilin是Rho/Rho激酶信号通路中的关键作用因子,Rho激酶抑制剂有神经保护和抗癫痫作用。本研究拟在细胞和动物水平上探讨Rho/Rho激酶信号通路在癫痫及其学习记忆障碍共病发生发展中的相关机制,找到治疗和预防癫痫及其学习记忆障碍共病的新策略。第一章Rho激酶抑制剂法舒地尔对经红藻氨酸处理的N2A细胞突起生长的作用研究目的:观察N2A细胞中红藻氨酸(kainic acid,KA)给药后Rho/Rho激酶信号通路和细胞突起的变化,并探讨抑制剂法舒地尔(Fasudil)的相关作用,以及LIMK和cofilin基因沉默对突起生长的影响。方法:以N2A为体外实验对象,Western-blot分析Rho/Rho激酶信号通路蛋白磷酸化水平。去除血清诱导细胞分化,KA、Fasudil及si-RNA对细胞形态和突起长度的影响采用相差显微镜实时观测或经固定后Rhodaminephalloidin免疫荧光染色检测。Si-RNA利用RNAi-Mate转染试剂转入细胞内。结果:200μM KA在给药0.5-8h均可见Rho/Rho激酶信号通路cofilin、LIMK、Rock2等蛋白磷酸化显著降低,其中以1h最为显著。Fasudil可显著抑制Rho/Rho激酶信号通路磷酸化水平的改变。无血清诱导分化后,细胞形态正常,KA处理1h后突起停止生长;Fasudil给药明显缓解KA所致突起生长抑制。KA给药4h后,Rho/Rho激酶信号通路磷酸化水平及细胞形态变化不显著。Si-RNA敲降LIMK和cofilin基因明显缓解KA所致突起生长抑制。结论:KA所致N2A形态改变和突起生长抑制与Rho/Rho激酶信号通路密切相关。第二章Rho激酶抑制剂法舒地尔对小鼠癫痫发作后树突棘减少和学习记忆损害的保护作用目的:观察Rho激酶抑制剂Fasudil对KA致痫小鼠Rho/Rho激酶信号通路改变、树突棘减少和学习记忆功能障碍的作用,明确Rho/Rho激酶信号通路介导的树突棘减少在KA致痫后学习记忆功能减退的作用。方法:KA诱导C57BL/6雄性癫痫发作小鼠为模型,Western-blot分析蛋白磷酸化水平采用,Golgi染色分析树突形态和树突棘计数,学习记忆功能和焦虑抑郁状态采用Morris水迷宫、旷场及悬尾实验检测。结果:KA诱导小鼠癫痫发作可使cofilin、LIMK、Rock2等蛋白磷酸化降低,SSH1和14-3-3蛋白磷酸化水平升高。KA致痫1h后树突棘数量显著减少,4h后有所恢复但与对照组相比仍较少。KA致痫4周后行为学实验结果显示KA致痫小鼠学习记忆能力下降和焦虑抑郁状态上升。Fasudil预防性给药可显著抑制KA致痫后Rho/Rho激酶信号通路的变化,缓解树突棘的丢失,改善学习记忆障碍和焦虑抑郁状态。结论:KA致痫引起的学习记忆能力下降和焦虑抑郁状态上升与Rho/Rho激酶信号通路去磷酸化导致的神经细胞形态改变和树突棘丢失密切相关。Fasudil可作为潜在的癫痫发生后神经保护作用药物。