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卵巢癌死亡率高居妇科恶性肿瘤之首,以上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)最为多见,主要治疗方案为手术辅以顺铂(Cisplatin,CDDP)为基础的化疗,而化疗过程中多药耐药的产生是其治疗失败的主要原因,因此,耐药机制研究已成为卵巢癌防治研究的热点与难点。Twist1在肿瘤发生发展中具有重要作用,并扮演着双重角色,一方面,其可诱导肿瘤细胞发生并维持上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),从而促进肿瘤侵袭与转移;另一方面,其可促进细胞增殖、抑制凋亡。此外,Twist1在肿瘤药物治疗抵抗中的作用逐渐引起重视,成为肿瘤研究领域的焦点。然而,关于Twist1在卵巢癌CDDP耐药及EMT中的作用及其调控机制尚不明确。近年来,关于mi RNAs参与肿瘤耐药与EMT表型调节的作用受到业界广泛认同。基于以上分析,本研究拟阐明mi R-186通过Twist1调控EOC细胞CDDP耐药与EMT的作用及分子机制,为EOC细胞多重恶性表型的逆转提供新思路,对卵巢癌的防治具有重大意义。一、CDDP耐药卵巢癌细胞EMT表型鉴定及Twist1的调控作用用显微镜观察CDDP耐药与敏感细胞形态,WB检测Twist1及EMT标记分子蛋白水平,观察耐药细胞是否具有EMT表型;构建Twist1干扰载体,转染耐药细胞,抑制Twist1表达,实时定量PCR(quantitative realtime PCR,q PCR)及WB分别检测Twist1 m RNA及蛋白水平,观察细胞形态及EMT标记分子变化,划痕实验检测细胞迁移能力,CCK-8检测细胞增殖并计算细胞对CDDP的IC50值,FCM检测细胞周期、细胞凋亡。结果表明:CDDP耐药细胞呈现间质样细胞形态,高表达间质标记蛋白(Vimentin)而低表达上皮性标记蛋白(E-cadherin);Twist1在耐药株中高表达,抑制Twist1可逆转EMT表型,上调E-cadherin,下调Vimentin,抑制细胞增殖及细胞周期进展,诱导细胞凋亡并增加EOC细胞对CDDP的敏感性。二、mi R-186调节EOC细胞EMT及CDDP耐药的作用与机制q PCR检测CDDP耐药与敏感细胞中mi R-186表达水平,分析其与Twist1表达的相关性,双荧光素酶报告基因进行靶标验证。在耐药细胞中转染mi R-186模拟物(mimics)加或不加Twist1重组载体预处理,在敏感细胞中转染mi R-186抑制物(mi R-186-INH),观察处理前后:mi R-186、Twist1及其下游靶基因表达变化,细胞形态及EMT标记分子变化,细胞迁移、增殖、周期、凋亡及对CDDP的IC50值变化;建立EOC裸鼠模型,观察mi R-186及Twist1对EOC细胞体内化疗耐药性的影响。我们发现:mi R-186在耐药细胞中低表达,与Twist1表达呈负相关,Twist1是mi R-186的直接靶基因;过表达的mi R-186可下调Twist1水平,解除Twist1对p53的抑制效应,逆转EMT表型,抑制细胞增殖及细胞周期进展,诱导细胞凋亡并增加EOC细胞对CDDP的敏感性,反之亦然;而在mi R-186过表达细胞中转染Twist1后,mi R-186逆转EMT及化疗增敏效应均被削弱;体内实验进一步证实了以上结论。三、mi R-186与EOC耐药的关系通过检测EOC组织标本中mi R-186与Twist1表达,分析二者表达的相关性及各自与EOC患者化疗敏感性及无病生存期的关系。临床分析发现:mi R-186与Twist1在EOC组织中表达负相关;高表达mi R-186或低表达Twist1预示EOC患者化疗敏感、无进展生存期较长,而低表达mi R-186或高表达Twist1预示EOC患者化疗耐药、无进展生存期较短。综上,本研究发现EOC细胞获得耐药的同时,伴发并维持着EMT表型;Twist1可同时诱导EMT并增加EOC细胞对CDDP的耐药性;Twist1是mi R-186的直接靶基因,过表达mi R-186可通过下调Twist1,上调p53,逆转EMT表型,增加EOC细胞对CDDP的体内外敏感性;EOC患者组织中高表达mi R-186或低表达Twist1预示化疗敏感、远期生存率高,反之亦然。这些研究结果阐释了mi R-186/Twist1调控EOC细胞EMT表型与耐药的新机制,为卵巢癌新的诊治策略提供了理论依据。