菊花脑低氮胁迫表达谱分析及microRNA挖掘

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菊花脑(Chrysanthemum nankingense)是原产中国的菊属二倍体物种,参与多倍体菊花(C. morifolium)的起源。氮素是植物生长所必须矿质元素之一。所以挖掘与低氮胁迫相关的基因或miRNA,对提高菊属植物氮素利用率,减少氮素流失有重要的意义。本研究以菊花脑为实验材料,采用Illumina高通量测序技术,分别构建了四个小分子丈库和四个cDNA文库,处理材料如下:最适生长的氮素浓度4 mmol L-1 NO3-处理的根;低氮度0.04 mmol L-1 N03-处理的根;最适生长的氮素浓度4 mmol L’1 NO3-处理的叶片;低氮浓度0.04 mmol L"1 NO3-处理的叶片。对表达谱和miRNA数据分别进行分析,主要结果如下:(1)四个cDNA文库都获得的大约7,000,000的clean reads.根非胁迫对照与根低氮胁迫组(R-sample)所得数据进行分析,差异表达基因有1,510个,其中上调基因458个,下调基因1052个;叶非胁迫对照与叶低氮胁迫组(L-sample)所得数据进行分析,差异表达基因有686个,其中上调基因419个,下调基因267个。根中与叶中差异表达基因相同的上调基因109个,下调基因67个。分别对根、叶的差异表达基因进行Gene Ontology功能分类和KEGG pathway显著性富集分析,以序列同源性为基础,分别把2,855和691条序列分成42和34个功能组。通过KEGG分析,在R-sample中,423个序列被富集为94个pathway;在L-sample中,138个序列被富集为94个pathway.(2)对差异表达基因进行归类分析,涉及光合作用、转录因子、氮素代谢和激酶。其中有2个与氮转运相关的基因(Unigene36710S21, Unigene82641S21为了检测数据的可靠性,随机抽选了15个基因进行qRT-PCR验证。qRT-PCR验证结果与高通量测序所测得结果的上调或下调趋势保持一致,说明测序结果可靠。(3)通过HiSeq深度测序检测菊花脑根部和叶片低硝酸盐响应的miRNA,并对其进行生物信息学分析。在根部检测到的差异表达2倍及以上的miRNA共82个,其中上调表达29个,下调表达53个;在叶片检测到的差异表达2倍以上的miRNA共102个,其中上调表达40个,下调表达62个。其中发现与已报道的响应低氮胁迫的同家族的miRNA,根部有miR169i-3p, miR398a-5p,叶片中有miR169r-3p和miR393a-3p等。(4)通过软件预测了差异表达的已知miRNA的靶基因。根部可预测到靶基因的miRNA数量为37,预测到的靶基因数量是219个,靶基因miRNA结合位点数量是235;叶片可预测到靶基因的miRNA的数量是44,预测到的靶基因个数是219,靶基因miRNA结合位点数量是204。根据预测靶基因的功能特性分为三类:靶基因与代谢相关,靶基因编码转录因子和靶基因编码激酶。我们随机抽取miRNA预测的靶基因进行qRT-PCR验证,其结果与测序结果的上调或下调趋势保持一致。
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